CIK細胞對卵巢癌化療耐藥的逆轉作用及對ERCC表達的影響*

王亞軍，袁 越，柳海燕，張 瓊，周 航△

(1.遵義醫學院附屬腫瘤醫院腹部腫瘤科，貴州遵義 563000;2.黔西南布依族苗族自治州人民醫院腫瘤科，貴州黔西南州 562400)

卵巢癌是惡性程度最高的婦科腫瘤，一般早期沒有癥狀，確診時有60%～70%的患者已屬晚期，故卵巢癌5年的生存率僅為30%[1]。卵巢癌的主要治療手段是腫瘤細胞減滅術和以鉑類藥物為基礎的聯合化療，鉑類藥物抗瘤療效確切，約80%的初治患者獲得顯著臨床緩解，但仍有部分患者初次化療不能控制病情，或者緩解后又發生腫瘤復發及轉移情況但再次化療效果欠佳，即出現多藥耐藥現象(multidrug resistance,MDR)，最終導致化療失敗[2-3]。因此探尋新的治療手段以逆轉化療耐藥是卵巢癌治療研究的必然選擇。

DNA損傷修復能力增強是導致卵巢癌順鉑耐藥的主要原因之一，由鉑-DNA加合物引起的DNA損傷修復主要通過核苷酸切除修復途徑，而切除修復交叉互補基因組1(ERCC1)和切除修復交叉互補基因組2(ERCC2)是該途徑的重要參與因子[4-8]。生物治療是近年來腫瘤治療中的重要進展之一，CIK細胞就是一種腫瘤過繼免疫治療方法。目前，國內外臨床上以CIK細胞為主導的腫瘤免疫細胞治療不斷取得新的進展[9-10]，但有關CIK細胞是否能夠抑制腫瘤細胞的DNA修復能力而逆轉腫瘤化療耐藥的研究少見報道。本研究就CIK細胞對卵巢癌耐藥細胞靈敏度的影響及其與ERCC1、ERCC2基因表達變化情況的關系進行研究，探索CIK細胞的治療作用是否與部分逆轉卵巢癌化療耐藥現象有關，為其治療卵巢癌可能提供新的機制和理論補充。

1 材料與方法

1.1細胞培養 人卵巢上皮癌細胞耐順鉑株(SKOV3/DDP細胞)及敏感親本細胞株(SKOV3細胞)均購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫，其中SKOV3/DDP細胞株是以對順鉑敏感的SKOV3為親本，使用順鉑連續作用并逐步提高藥量而形成的耐藥株。兩組細胞均用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液在37 ℃、5% CO2的孵箱內進行培養。CIK細胞是直接由本院細胞工程實驗室(負責完成CIK細胞體外誘導及質量控制工作)提供。

1.2試劑與藥品 RPMI-1640培養基、胎牛血清均購自美國Hyclon公司，MTT試劑購自美國Sigma公司，聚合酶鏈反應(PCR)引物、反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(Real-time PCR)反應試劑盒均購自日本TaKaRa公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司，兔抗ERCC 1、兔抗ERCC 2 (XPD)購自美國Cell Signaling公司，兔抗β-actin購自博士德生物工程有限公司，山羊抗兔辣根酶標記購自北京中衫公司，PVDF膜購于美國Millipore公司，順鉑(DDP)購自德州德藥制藥有限公司。

1.3MTT法檢測CIK細胞作用靶細胞前、后對DDP化療敏感性的變化

1.3.1將對數生長期的SKOV3、SKOV3/DDP細胞制成5×104/mL的細胞懸液接種于無菌96孔培養板中，每孔100 μL。24 h后將不同濃度DDP(DDP藥物終濃度分別為48.00、24.00、12.00、6.00、3.00、1.50、0.75 μg/mL)加入96孔板，每孔100 μL，每組設6個復孔。同時設置陰性對照組(不加順鉑)和調零組，放置在37 ℃、5% CO2的孵育箱中培養24 h。MTT法測光密度(OD)值，計算兩組細胞的抑制率。

1.3.2按上述方法加CIK細胞，將CIK細胞以不同效靶比(80∶1、40∶1、20∶1、10∶1)加入 96 孔板，每孔100 μL，每組設6個復孔。同時設置陰性對照組(不加CIK細胞)和調零組。計算兩組細胞的抑制率、IC10值(即非細胞毒性劑量)。

1.3.3按上述方法加入無毒劑量CIK細胞后，再加入DDP。實驗組中的兩組細胞均加入各自IC10對應效靶比的CIK細胞，每孔100 μL，每組6個復孔，同時設置陰性對照組(等體積RPMI-1640培養液)和調零組。待培養24 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復清洗去掉CIK細胞，再加入不同濃度DDP(DDP濃度同1.3.1)，每孔100 μL，繼續孵育24 h。計算兩組細胞的抑制率及逆轉倍數(RF)。

1.4real-time PCR檢測ERCC1、ERCC2 mRNA的表達 real-Time PCR檢測DDP、無毒劑量CIK及CIK細胞分別作用兩組細胞24 h后ERCC1、ERCC2 mRNA的表達情況。將上述細胞擴大培養，TRIzol法分別提取總RNA，反轉錄合成cDNA，再進行 PCR 擴增(PCR 引物序列見表1)。PCR反應條件：預變性 95 ℃ 30 s，進行1個循環 ；PCR反應95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，進行40個循環)；55 ℃開始，每0.4 ℃采集1次熒光，每次10 s，共采集100次。在PCR擴增過程中設立無模板陰性對照。采用2-△△CT法進行相對定量分析，以β-actin為內參基因對上樣量進行校正。每組設3個樣本，重復3次。

表1 引物制備及引物序列

1.5Western-blot檢測ERCC1、ERCC2蛋白的表達 Western-blot檢測DDP、無毒劑量CIK及CIK細胞分別作用兩組細胞24 h后ERCC1、ERCC2蛋白的表達情況。細胞裂解液冰浴細胞5 min提取總蛋白后，BCA法對總蛋白進行定量。總蛋白加十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液后，沸水浴3～5 min。以聚丙烯酰胺凝膠電泳(PVGE)，凝膠上的蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉40 min，分別加入兔抗人ERCC1單克隆抗體、兔抗人ERCC2單克隆抗體和兔抗人β-actin單克隆抗體(均1∶1 000稀釋)一抗4 ℃輕搖過夜，洗脫，辣根過氧化酶標記二抗室溫輕搖1 h，洗脫。PVDF膜采用增強化學發光顯影X膠片，暗室曝光。使用Quantity one圖像分析軟件測定蛋白質條帶的灰度值，以β-actin作為內參后計算其蛋白相對表達水平。重復3次。

2 結 果

2.1DDP、CIK細胞、CIK細胞聯合DDP對SKOV3、SKOV3/DDP細胞增殖的影響 DDP對SKOV3、SKOV3/DDP細胞均有殺傷效應，且兩組靶細胞的殺傷率均隨DDP濃度的增加而增強(表2)，DDP對SKOV3、SKOV3/DDP細胞的IC50值分別為(2.47±0.01)、(6.96±0.03)μg/mL，相同濃度作用下，DDP對SKOV3的殺傷活性高于SKOV3/DDP，差異有統計學意義(P<0.05)。CIK細胞對SKOV3、SKOV3/DDP細胞均有殺傷效應，且殺傷活性隨效靶比的增高而增強(表3)，CIK細胞對SKOV3、SKOV3/DDP細胞的IC10效靶比(即無毒劑量效靶比)分別為16.92∶1和14.09∶1，相同效靶比作用下，CIK細胞對SKOV3/DDP的殺傷活性高于SKOV3，差異有統計學意義(P<0.05)。加用CIK細胞共培養后，發現DDP對SKOV3和SKOV3/DDP的體外殺傷活性顯著增強(表4)，無毒劑量CIK細胞聯合DDP作用后，SKOV3/DDP細胞的IC50降低為(4.90±0.02)μg/mL，RF=1.42，即與單純DDP作用相比，CIK細胞聯合DDP對SKOV3/DDP具有較明顯的協同作用，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2CIK細胞干預SKOV3、SKOV3/DDP前后ERCC1和ERCC2 mRNA的表達情況 SKOV3和SKOV3/DDP細胞株中ERCC1 mRNA的相對表達量分別為0.78±0.03和0.98±0.13；ERCC2 mRNA的相對表達量分別為0.23±0.03和0.56±0.01，即SKOV3/DDP和SKOV3相比，ERCC1、ERCC2 mRNA表達量均明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。當CIK細胞干預SKOV3和SKOV3/DDP細胞株后，ERCC1 mRNA的相對表達量分別為1.11±0.02和0.71±0.02；ERCC2 mRNA的相對表達量分別為0.39±0.08和0.45±0.06，即CIK細胞干預SKOV3/DDP細胞株后，與未干預組相比,ERCC1 mRNA 表達量顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)；ERCC2 mRNA表達水平下降，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、2。

表2 DDP作用SKOV3、SKOV3/DDP細胞24 h后的抑制率%)

*：P<0.05，與SKOV3細胞比較

表3 CIK細胞作用SKOV3細胞、SKOV3/DDP細胞24 h的抑制率%)

*：P<0.05，與SKOV3細胞比較

表4 無毒劑量CIK細胞聯合順鉑作用SKOV3細胞、SKOV3/DDP細胞24 h的抑制率%)

*：P<0.05，與SKOV3細胞比較

2.3CIK細胞干預SKOV3、SKOV3/DDP前后ERCC1和ERCC2蛋白的表達情況 SKOV3和SKOV3/DDP細胞株中ERCC1蛋白的相對表達水平分別為0.39±0.01和0.59±0.00；ERCC2 蛋白的相對表達水平分別為0.69±0.00和0.59±0.00，即SKOV3/DDP和SKOV3相比，ERCC1、ERCC2 蛋白表達水平均增高，差異有統計學意義(P<0.05)。當CIK細胞干預SKOV3和SKOV3/DDP細胞株后，ERCC1蛋白的相對表達水平分別為0.39±0.08和0.45±0.06；ERCC2蛋白的相對表達水平分別為0.41±0.08和0.33±0.01。Western-blot提示CIK細胞干預SKOV3/DDP細胞后，ERCC1、ERCC2蛋白均表達下降，但ERCC1蛋白表達量下降差異有統計學意義(P<0.05)，而ERCC2蛋白表達水平下降，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、4。

*：P<0.05，與SKOV3/DDP+CIK比較；#：P<0.05，與SKOV3比較

圖1各組細胞中ERCC1 mRNA的表達

*：P<0.05，與SKOV3/DDP+CIK比較；#：P<0.05，與SKOV3比較

圖2各組細胞中ERCC2 mRNA的表達

1:SKOV3/DDP;2:SKOV3/DDP+CIK;3:SKOV3;4:SKOV3+CIK

圖3各組細胞中ERCC1蛋白的表達

1:SKOV3/DDP;2:SKOV3/DDP+CIK;3:SKOV3;4:SKOV3+CIK

圖4各組細胞中ERCC2蛋白的表達

3 討 論

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤,腫瘤細胞減滅術和以鉑類藥物為基礎的聯合化療是治療卵巢癌的主要手段，其中鉑類藥物抗瘤療效確切，但長期應用所產生的耐藥性，成為卵巢癌治療難以獲得顯著效果的主要瓶頸。細胞免疫治療是一種被認為有可能治愈癌癥的方法，它通過打破機體對腫瘤細胞的免疫耐受，增強機體免疫系統對腫瘤的免疫反應[11-12]。關于細胞免疫治療聯合化療協同治療惡性腫瘤已有相關報道[13-14],但對MDR腫瘤的協同治療報道較少,且尚未闡明這一互補性殺傷的機制。

本研究中采用了MTT法檢測DDP對人卵巢癌細胞SKOV3及卵巢癌耐DDP細胞SKOV3/DDP兩組細胞的體外殺傷效應。結果顯示DDP對SKOV3及SKOV3/DDP的殺傷活性均隨DDP濃度的增高而增強，但與SKOV3細胞相比，同濃度DDP對SKOV3/DDP細胞的體外殺傷活性更低，說明與親代敏感細胞相比，DDP殺傷耐藥卵巢癌細胞效應的能力顯著下降。以往的研究已證明DDP是一種與細胞DNA結合，誘導細胞凋亡的鉑類化合物，本研究結果亦證實卵巢癌敏感和耐藥細胞凋亡是DDP發揮細胞毒效應的結果。本研究還顯示CIK細胞對耐藥細胞SKOV3/DDP的殺傷效應高于SKOV3，與文獻[15]報道相符。石永進等[16]研究認為CIK細胞可能是導致化療藥物在MDR腫瘤細胞內積累量明顯增加的主要原因之一，尤其是MCF7adr核膜上P-gp表達的降低，必將導致化療藥物更易于進入其作用靶點-細胞核，進而引起免疫效應細胞聯合低于IC50劑量的化療藥物，對MDR腫瘤細胞的殺傷活性明顯高于單純用同等劑量化療藥物或單純用相同效靶比的CIK細胞殺傷活性。本研究結果發現，CIK細胞聯合DDP對兩種靶細胞的殺傷活性均隨DDP濃度的升高而增加，且較單純使用DDP或CIK細胞的殺傷活性明顯增加，且在低效靶比CIK細胞聯合化療藥物作用于SKOV3/DDP細胞的情況下，仍可大幅度提高耐藥細胞對化療藥物的靈敏度，提示CIK細胞存在部分逆轉化療藥物耐藥的作用。因此，CIK細胞聯合DDP治療耐藥性卵巢癌患者有可能會成為發展前景良好的綜合治療方案，值得進一步研究探討。

DNA損傷修復能力增強是鉑耐藥的主要原因，核苷酸切除修復(nucleotide excision repair,NER)是DNA修復機制中的一條重要途徑[4]。ERCC1是NER途徑的限速酶，有研究顯示ERCC1基因的高表達與DDP在多種腫瘤中的耐藥性相關，還可作為判斷腫瘤患者鉑類藥物化療靈敏度的指標[16-17]；封閉或下調ERCC1基因可逆轉卵巢癌細胞鉑耐藥[18]。ERCC2是NER通路中一種重要DNA修復基因，它能使受損的DNA被特異性核酸內切酶切除，進而使受損DNA得以修復[19-20]。肺癌中ERCC2各基因型與鉑類化療緩解率相關性的研究結果報道不一，甚至有研究報道稱，ERCC2的單核苷酸多態性(SNP)與化療靈敏度無關[21]，然而ERCC2基因在卵巢癌組織中的表達與藥物化療療效、耐藥之間關系的報道尚無定論。本次實驗利用Real-time PCR及Western blot檢測SKOV3、SKOV3/DDP細胞經無毒劑量的CIK細胞干預前后ERCC1、ERCC2 mRNA及蛋白的表達情況，結果提示CIK細胞逆轉卵巢癌細胞的耐藥性可能與ERCC1 mRNA表達下調有關，同時佐證了ERCC1基因在腫瘤細胞耐藥中的重要作用，為今后臨床應用CIK細胞提高卵巢癌化療藥物靈敏度及改善患者的生存和預后提供更有力的實驗證據。但腫瘤的發生、發展及轉移是由多基因、多因素共同作用的結果，因此還需要深入研究與ERCC1共同作用的相關基因及其導致卵巢癌耐藥的作用機制。本研究結果還顯示，SKOV3/DDP細胞內ERCC2 mRNA及蛋白的表達均明顯高于SKOV3細胞，說明ERCC2可能與SKOV3/DDP細胞對DDP耐藥相關，但CIK細胞未能降低SKOV3/DDP中ERCC2的mRNA及蛋白表達，提示CIK細胞逆轉SKOV3/DDP細胞對DDP的耐藥作用可能與ERCC2無相關性。目前有關ERCC2基因與卵巢癌耐藥療效判斷的相關數據十分有限，DDP的耐藥性及逆轉耐藥作用與ERCC2關系還有待進一步擴大樣本量研究，并與其他DNA修復基因進行聯合分析。