高效液相色譜法對鰱魚、鳙魚和草魚肌肉中氨基酸含量的測定

李 燕，謝 勇，楊發輝

（1.重慶市水產科學研究所，重慶 江北 400020；2.重慶市榮昌區農業委員會，重慶 榮昌 402460）

鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙魚（Aristichthys nobilis）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）和青魚（Mylopharyngodon peters）合稱四大家魚，是我國主要的淡水經濟魚類［1，2］，在西南地區前3種的產量和消費量更大，因肉質鮮嫩，價格便宜成為內陸群眾水產品的首選。目前它們的養殖技術成熟［3－5］、養殖規模大、價格便宜。目前對它們營養成分的研究較少，研究面較窄，且用高效液相色譜儀檢測的較少，本試驗檢測了四大家魚中鰱魚、鳙魚、草魚的營養價值。

氨基酸的檢測方法有離子交換色譜法［6－8］、高效液相色譜法［9－15］、氣相色譜法［16］、毛細管電泳法［17］等，目前國標檢測方法所用的是氨基酸分析儀離子交換色譜法，但高效液相色譜儀因使用范圍廣，價格較氨基酸分析儀便宜，很多機構和學者也在嘗試用高效液相色譜儀檢測水產品中的氨基酸含量，本試驗建立了用高效液相色譜儀的紫外檢測器（DAD）和熒光檢測器（FLD）檢測氨基酸的方法，該方法操作簡單，試劑用量少，準確度高，可為其他科研或檢測機構檢測氨基酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司，配紫外和熒光檢測器；BT25S型十萬分之一電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DHG－90HA型電熱鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；SHB－Ⅲ型循環水式多用真空泵，鞏義市科瑞儀器有限公司。

17種氨基酸標準品：濃度為1 nmol/μL，每支1 mL，中國計量科學研究院。

鄰苯二甲醛（OPA）、9－芴甲基氯甲酸酯（FMOC）、硼酸緩沖液均為進口分裝好的試劑，密度分別為10 mg/mL、0.78 g/mL 和 1.00 g/mL（pH=10.2），可直接使用。

磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；甲醇、乙腈均為進口色譜純，霍尼威爾。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制 取1 mL氨基酸標準品，轉移至10 mL容量瓶中，用超純水反復潤洗盛裝標準品的安培瓶，洗液合并倒入容量瓶內，定容至10 mL，配制成100 nmol/mL的混標。再配制濃度為100、80、50、25、10 nmol/mL的混標，4℃保存。

1.2.2 樣品的制備 取魚肌肉勻漿，105℃烘干（恒重法）研磨成粉，過40目篩，稱取約30 mg干樣于水解管中，加入10 mL 6 mol/L的鹽酸溶液，用氮氣吹掃5 min，水解管連接到真空泵上，抽氣10 min，放入鼓風干燥箱內110±1℃水解24h。水解完后用12mL 6 mol/L的氫氧化鈉中和至弱堿性，定容至25 mL，待測。

1.2.3 色譜條件 試驗建立了能實現標準品溶液和樣品溶液的自動衍生化過程。自動進樣器自動進樣設置見文獻［18］。

流動相 A：40 mmol/L 的 Na2HPO4，pH 7.8（稱取6.2 g NaH2PO4·2H2O 定容至 1 L，用 6 mol/L 的氫氧化鈉調 pH 至 7.8）；流動相 B∶乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10。 色譜柱：Eelipse－AAA 色譜柱，4.6 mm×150 mm，5 μm。二極管陣列檢測器 （DAD）和熒光檢測器（FLD）。DAD 波長設置：0～16 min，檢測波長為 338 nm，10 nm帶寬，參比 390 nm，20 nm 帶寬；16 min后檢測波長為262 nm，16 nm帶寬，參比324 nm，8 nm帶寬；峰寬都為 0.1 min。 FLD 波長設置：0～15.5 min，激發波長為340 nm，發射波長為450 nm，增益10；15.5 min后激發波長為266 nm，發射波長為305 nm，增益9；峰寬都為0.2 min。柱溫40℃。梯度洗脫條件見表1，流速2 mL/min。

表1 梯度洗脫條件

2 結果與分析

2.1 氨基酸標準曲線

配制濃度為 100、80、50、25、10 nmol/mL 的 17種氨基酸混標，同時用DAD和FLD進行檢測。結果表明，17種氨基酸均能被DAD檢測，線性相關系數在 0.9985～0.9999；除半胱氨酸外的其他 16 種氨基酸均能被 FLD 檢測，線性相關系數在 0.998 1～0.999 9；線性關系均較好，標準品的DAD譜圖和FLD譜圖見圖1和圖2，各氨基酸的標準曲線及相關系數見表2。

圖1 17種氨基酸標準品的DAD圖譜

圖2 16種氨基酸標準品的FLD圖譜

表2 各氨基酸的回歸方程、相關系數

2.2 重現性、檢出限和定量限

用5 nmol/mL的氨基酸混合標準液連續進樣6次，FLD檢測器檢測，計算峰面積的相對標準偏差（RSD）表示儀器的重現性。

當各氨基酸的信噪比為3時，以此時的標準品濃度或質量為檢出限，本試驗用10 nmol/mL的氨基酸混合標液來測定DAD檢測器的檢出限，用1 nmol/mL的氨基酸混合標液來測定FLD檢測器的檢出限。

當各氨基酸的信噪比為10時，以此時的濃度為定量限，本試驗的定量限由檢出限換算而得。

對比DAD檢測器和FLD檢測器的檢出限，FLD的檢出限和定量限都更低；FLD能檢測1 nmol/mL的氨基酸混合標樣，譜圖效果較好，能清楚地區分各個峰；DAD檢測器能檢測10 nmol/mL的氨基酸混合標樣，譜圖效果較好。各種氨基酸的重現性、檢出限、定量限的數據如表3所示。

表3 檢出限、定量限和重現性

2.3 樣品分析結果

鰱魚、鳙魚、草魚的氨基酸水解液經檢測后，17種氨基酸含量以DAD的檢測結果來統計，必需氨基酸含量以FLD和DAD檢測結果的平均值來統計（圖3至圖8、表4）。結果表明，鰱魚的氨基酸總量為145.46 mg/g，其中必需氨基酸占總氨基酸的35.75%；鳙魚的氨基酸總量為 127.49 mg/g，其中必需氨基酸占總氨基酸的34.67%；草魚的氨基酸總量為124.10 mg/g，其中必需氨基酸占總氨基酸的36.24%。

3 小結與討論

經查閱文獻得知色氨酸需要堿水解［19］后才能檢測，本試驗用的是酸水解方法，因此文中未涉及色氨酸的檢測數據，但該上機檢測方法同樣適用于色氨酸。樣品放入鼓風干燥箱內水解前，抽真空要足夠長（每個樣品至少抽5 min），并要防止漏氣，如水解后消解用的鹽酸體積變小，有可能是漏氣，會使檢測結果偏低。

圖3 鰱魚樣品的FLD檢測結果

圖5 鳙魚樣品的FLD檢測結果

圖6 鳙魚樣品的DAD檢測結果

圖7 草魚樣品的FLD檢測結果

圖8 草魚樣品的DAD檢測結果

表4 鰱魚、鳙魚、草魚的氨基酸含量 （單位：mg/g）

目前用高效液相色譜儀檢測半胱氨酸都是在紫外條件下檢測［20］，主要是因為半胱氨酸衍生化后對熒光的吸收差，不能用熒光檢測器檢測，因此本試驗中FLD也只能檢測17種混標中的16種氨基酸。試驗所用高效液相色譜儀配備的自動進樣器能實現進樣時自動吸取樣品和衍生試劑完成柱前衍生化過程，在衍生過程中，標液或樣品、OPA、FMOC的體積比為1∶1∶1，硼酸鹽緩沖液是為了將樣品調節為弱堿性，水和乙腈的作用是洗針和稀釋的作用。試驗嘗試不用自動進樣器衍生化，采用人工衍生化，按照自動進樣器相同的比例精確地取0.5 mL樣品或標準品，0.5 mL OPA，0.5 mL FMOC 和 2.5 mL 硼酸鹽緩沖液，混合均勻后用精密pH試紙測pH在9左右，呈弱堿性。上機檢測結果表明17種氨基酸都能檢出，但重現性較自動進樣器差，且所消耗的標準品和衍生試劑較多。

采用氨基酸柱，以磷酸氫二鈉、甲醇、乙腈、水為流動相，建立了OPA－FMOC試劑聯用柱前衍生氨基酸的高效液相色譜分析方法，標準品和樣品同時用DAD和FLD檢測，在26 min內17種氨基酸能較好的分離。樣品在兩個檢測器上的檢測結果相差很小，在判定必需氨基酸含量時取兩個檢測結果的平均值。結果表明，鰱魚、鳙魚和草魚肌肉內至少含有17種氨基酸，必需氨基酸占總氨基酸比例分別為35.75%、34.67%、36.24%，與孔保華等［21］、姜啟興等［22］、王雪峰等［23］所報道結果基本一致。