WIF1在宮頸癌中的表達(dá)及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

鄭小妹，林葉飛，張韶瓊，陳曼玲

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科,海口 570000)

宮頸癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，近些年來(lái)發(fā)病率逐年上升，并呈現(xiàn)年輕化[1-2]。目前研究表明，人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，但宮頸癌的發(fā)生機(jī)制尚不明確，其中基因表達(dá)異常引起的信號(hào)通路紊亂是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要原因[2-3]。Wnt是從乳頭瘤病毒誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的一種與胚胎發(fā)育密切相關(guān)的基因，其所介導(dǎo)的信號(hào)通路參與機(jī)體胚胎發(fā)育的全過(guò)程[4]。Wnt信號(hào)通路通過(guò)經(jīng)典和非經(jīng)典兩條信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，特別是在腫瘤組織中處于異常激活的狀態(tài)[5-6]。而且越來(lái)越多研究顯示W(wǎng)nt信號(hào)通路的抑制因子沉默可能是引起Wnt信號(hào)激活的重要原因[7]。WIF1作為Wnt信號(hào)通路的分泌性拮抗因子，與信號(hào)通路蛋白Wg和XWnt8有較高的親和力，因此在眾多腫瘤組織或細(xì)胞系中低表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7-9]。但是對(duì)于WIF1在宮頸癌中的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制尚少見(jiàn)報(bào)道，因此本研究將對(duì)此展開(kāi)探討，以期進(jìn)一步的闡明宮頸癌的發(fā)生機(jī)制，為宮頸癌的基因治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本的來(lái)源 收集2012年3月至2016年12月本院外科手術(shù)切除的宮頸癌組織及癌旁正常組織各82例，所有標(biāo)本經(jīng)病理確診均為宮頸鱗癌。其中高分化鱗癌(Ⅰ級(jí))32例，中分化鱗癌(Ⅱ級(jí)也稱為非角化性大細(xì)胞型)30例，低分化鱗癌(Ⅲ級(jí)也稱為小細(xì)胞型)20例。術(shù)前所有患者未進(jìn)行化療、放療及生物治療，且都經(jīng)過(guò)病理學(xué)、影像學(xué)確診。

1.2方法

1.2.1主要試劑及儀器 宮頸癌Hela細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。兔抗人CyclinD1、C-myc、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9及GAPDH單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南通碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑盒，一步法RT-PCR試劑盒，LipofectamineTM2000均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；pcDNA3.1 WIF1 真核表達(dá)載體及空白質(zhì)粒pcDNA3.1均購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2.2RT-PCR法檢測(cè)WIF1 mRNA含量 根據(jù)Trizol試劑盒提取細(xì)胞總的RNA，并檢測(cè)總RNA純度，通過(guò)一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染 當(dāng)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到50%時(shí)候，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將pcDNA3.1 WIF1 真核表達(dá)載體(過(guò)表達(dá)組)及空白質(zhì)粒pcDNA3.1(對(duì)照組)轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，6 h后換液，采用Western blot 及RT-PCR法檢測(cè)WIF1表達(dá)。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將Hela細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，按“1.2.3”轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h，加入MTT孵育4 h，舍棄上清液，再加入150 μL的二甲基亞砜，振蕩使結(jié)晶物溶解，于酶標(biāo)儀上測(cè)定A560 nm值。

1.2.5Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將8×103個(gè)Hela細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，按“1.2.3”轉(zhuǎn)染48 h后，每組收集1×105/mL個(gè)細(xì)胞，加入結(jié)合緩沖液吹打混勻后，再依次加入5 μL的Annexin V-FITC及PI，繼續(xù)吹打混勻，并于室溫避光孵育10 min，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將8×103個(gè)Hela細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，按“1.2.3”轉(zhuǎn)染48 h后，每組收集1×105/mL個(gè)細(xì)胞，加Rnase吹打混勻后，37 ℃孵育1 h，再加入PI染液避光孵育30 min，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)分析。

1.2.7Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel膠平鋪于Transwell小室上，備用。將按“1.2.3”轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸浮液接種于Transwell上室，而下室不接種細(xì)胞(僅含有相應(yīng)培養(yǎng)基)，培養(yǎng)48 h后，將小室取出來(lái)，多聚甲醛下室細(xì)胞，并用結(jié)晶紫染色，最后在倒置顯微鏡下觀察并取5個(gè)視野中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值，即為細(xì)胞的侵襲數(shù)目。

1.2.8Western blot檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá) 將8×103個(gè)Hela細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，按“1.2.3”轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞并裂解得到總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白煮沸變性后，制作濃縮膠及分離膠并于室溫水封30 min。樣品上樣后進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。2%的BSA室溫下孵育1 h，一抗溶液(兔抗人CyclinD1、C-myc、MMP-2、MMP-9及GAPDH單克隆抗體) 4 ℃過(guò)夜孵育，第2天在室溫條件下，于二抗溶液孵育1～2 h，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

2 結(jié) 果

2.1WIF1在宮頸癌組織及癌旁組織中的表達(dá) 采用Western blot及RT-PCR法檢測(cè)82例宮頸癌組織及癌旁組織中WIF1的表達(dá)，見(jiàn)圖1；與癌旁組織比較，宮頸癌組織中WIF1蛋白[(0.89±0.09)vs.(0.13±0.01)]及mRNA[(1.12±0.11)vs.(0.14±0.01)]表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)。

圖1 WIF1在宮頸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2WIF1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的檢測(cè) 與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組中WIF1蛋白[(0.13±0.01)vs.(0.95±0.09)]及mRNA[(0.18±0.01)vs.(0.97±0.07)]表達(dá)量均顯著提高(P<0.01),見(jiàn)圖2。

圖2 WIF1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的檢測(cè)

2.3WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組(0.68±0.06)比較，過(guò)表達(dá)組(0.37±0.03)細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)。

2.4WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率顯著提高(P<0.01)，并使細(xì)胞周期阻滯于G1期(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響

a：P<0.01，與對(duì)照組比較

2.5WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌Heal細(xì)胞侵襲能力的影響 與對(duì)照組(189.43±15.39)比較，過(guò)表達(dá)組(49.51±5.12)侵襲數(shù)目顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

2.6WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞中C-myc、CyclinD1、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)量的影響 與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組中C-myc、CyclinD1、MMP-2及MMP-9表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖4、表2。

圖3WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌Heal細(xì)胞侵襲能力的影響(×200)

圖4WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞中C-myc、CyclinD1、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)量的影響

表2 WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞中C-myc、CyclinD1、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)量的影響

a：P<0.01，與對(duì)照組比較

3 討 論

Wnt信號(hào)通路是一種真核生物中高度保守的與胚胎發(fā)育密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)Wnt配體與Frizzled受體結(jié)合，將信號(hào)傳遞給GSK-3β-Axin-APC復(fù)合體，進(jìn)而導(dǎo)致β-catenin蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的積聚，并進(jìn)入細(xì)胞核，引起與LEF/TCF相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(CyclinD1、C-myc等)的表達(dá)[4-6]。WIF1作為Wnt信號(hào)通路的分泌性拮抗因子，最初于人視網(wǎng)膜組織中被發(fā)現(xiàn)，后在大鼠、蟾蜍和斑馬體內(nèi)中也被證實(shí)存在著。WIF1能夠與Wnt配體競(jìng)爭(zhēng)與Frizzled受體的結(jié)合，阻斷Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生。研究顯示W(wǎng)nt信號(hào)通路在包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中被激活，高度表達(dá)，原因可能是Wnt信號(hào)通路拮抗因子失活或者沉默所導(dǎo)致的[4-6]。而WIF1作為Wnt分泌性拮抗因子，在宮頸癌中的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制尚少見(jiàn)報(bào)道，因此本研究將對(duì)此展開(kāi)探討。

本研究首先采用Western blot及RT-PCR法檢測(cè)經(jīng)本院手術(shù)的82例宮頸癌組織及癌旁組織中WIF1的表達(dá)，結(jié)果表明癌組織中WIF1蛋白及mRNA表達(dá)量均顯著低于癌旁正常組織，與WIF1在其他腫瘤組織中的表達(dá)趨勢(shì)一致[7-8]，說(shuō)明WIF1在宮頸癌的發(fā)生過(guò)程中起著抑癌作用。且目前研究顯示W(wǎng)IF1在多數(shù)腫瘤組織及細(xì)胞株中低表達(dá)，并與癌細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移侵襲等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)[8-10]。提示W(wǎng)IF的低表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為可能產(chǎn)生顯著影響，本研究將對(duì)此展開(kāi)探討。

本研究利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染W(wǎng)IF1真核表達(dá)載體，并通過(guò)Western blot及RT-PCR法證實(shí)了轉(zhuǎn)染的成功。進(jìn)一步采用MTT，Annexin V-FITC/PI流式雙染技術(shù)檢測(cè)WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞活力及凋亡的影響，結(jié)果表明WIF1過(guò)表達(dá)能顯著的降低Hela細(xì)胞活力，并提高細(xì)胞凋亡率，與WIF1在其他腫瘤細(xì)胞中的作用一致[11-12]，說(shuō)明WIF1過(guò)表達(dá)能顯著的抑制Hela細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

宮頸癌細(xì)胞的凋亡受限制源自于細(xì)胞周期的不可控制，因此細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)G1、S、G2成為多種抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)[13]。因此本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明WIF1過(guò)表達(dá)能使細(xì)胞周期阻滯于G1期，提示W(wǎng)IF1過(guò)表達(dá)可能通過(guò)阻斷DNA的復(fù)制進(jìn)而抑制Hela細(xì)胞的增殖。CyclinD1是與G1期密切相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白，先于G1表達(dá)，并與細(xì)胞周期依賴性蛋白4(CDK4)/CDK6結(jié)合形成復(fù)合物，促使Rb磷酸化及核轉(zhuǎn)錄因子E2F進(jìn)入細(xì)胞核，推動(dòng)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。C-myc是原癌基因Myc的成員之一，定位于8號(hào)染色體，在腫瘤組織中持續(xù)性表達(dá)進(jìn)而加速G1期向S期的轉(zhuǎn)換，促使腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)換[14]。因此本研究進(jìn)一步的探討WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞中CyclinD1、C-myc蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明WIF1過(guò)表達(dá)能顯著下調(diào)CyclinD1、C-myc表達(dá)，進(jìn)而使Hela細(xì)胞周期阻滯于G1期。

腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤切除手術(shù)失敗的重要原因之一[15]。細(xì)胞外基質(zhì)降解是癌細(xì)胞進(jìn)行遠(yuǎn)處擴(kuò)散的先決條件，這一降解過(guò)程主要由MMPs所介導(dǎo)。MMPs是一類依賴于Zn2+的蛋白水解酶，其中明膠酶MMP-2和MMP-9不僅能夠降解基膜主要成分Ⅳ膠原，層連蛋白等，還能夠誘導(dǎo)血管新生，促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)擴(kuò)散。目前研究證實(shí)高表達(dá)的MMP-2、MMP-9與宮頸癌的高侵襲性正相關(guān)[15]。因此本研究通過(guò)Transwell法、Western blot法分別檢測(cè)WIF1過(guò)表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞侵襲能力及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明WIF1過(guò)表達(dá)能顯著的下調(diào)MMP-2及MMP-9表達(dá)，進(jìn)而抑制Hela細(xì)胞侵襲。

綜上所述，WIF1在宮頸癌組織中低表達(dá)，WIF1過(guò)表達(dá)能顯著的降低Hela細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，并抑制細(xì)胞侵襲能力，此過(guò)程可能與下調(diào)CyclinD1、C-myc、MMP-2及MMP-9表達(dá)有關(guān)。