對氧磷酶1 rs662位點單核苷酸多態性與氟骨癥關系的病例對照研究*

劉 俊陶 娜羅明江，趙 訓，楊 勝，張元梅，王克躍△

(1.遵義醫學院預防醫學實驗教學中心，貴州遵義 563006； 2.貴州省預防醫學實驗教學示范中心，貴州遵義 563006；3.遵義醫學院附屬醫院藥劑科，貴州遵義 563006； 4．貴州省遵義市第四人民醫院院感科 563004；5.貴州省畢節市織金縣疾病預防控制中心慢性病防治科 552100)

地方性氟中毒是人體長期在特定地理環境中攝入了過量的氟而造成的全身慢性蓄積性中毒，主要表現為氟斑牙和氟骨癥，其中氟骨癥是致殘、致癱、降低勞動能力的主要病變。曾報道貴州省地方性氟中毒區人口大概1 900萬人，氟骨癥患者約65萬人[1]。如此嚴重的地方病對病區居民的身體健康和經濟發展帶來重大影響[2]。既往研究發現氟暴露地區不是所有人均會患氟骨癥，氟骨癥的發生可能與遺傳易感性存在密切關系[3-4]。研究證實，氧化應激和內質網應激都有可能為地方性氟中毒中氟骨癥的發病機制[5-6]。因此，氧化應激相關基因可能與氟骨癥易感性之間存在關聯。對氧磷酶(Paraoxonase，PON)是一種鈣離子依賴性磷酸酯酶，能夠阻止脂質過氧化的生成，在氧化應激中起重要作用[7]。PON基因家族包括PON1、PON2和PON3等至少3個基因，其中PON1是對氧磷酶家族研究最多且最知名的成員。PON1 基因位于 7號染色體長臂 7q21.3-22.11上,長約259 kb，包含8個內含子和9個外顯子[8]。既往研究發現，PON1與氧化應激相關疾病，如骨質疏松癥、冠狀動脈疾病、卒中、糖尿病和代謝綜合征等疾病有關[9-10]。目前尚少有研究探討PON1基因多態性與氟骨癥之間的關系。因此，本次研究旨在通過病例對照研究方法，探討PON1基因rs662位點單核苷酸多態性與氟骨癥之間的關系，為氟中毒的早期防治提供人群研究資料和理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 在貴州省畢節市織金縣招募195例氟中毒患者，在上述地區招募195例無骨骼和牙齒相關疾病的成年人作為對照組。(1)納入與排除標準： 納入病例為根據診斷標準確診的氟骨癥患者。氟骨癥按《地方性氟骨癥臨床分度標準》(GB16396-1996)，結合流行病學和臨床表現癥狀，由氟骨癥專家做出診斷。納入的所有對象排除各種病理性骨折、高能量(暴力性)骨折及其他暴力所致骨折。且排除腫瘤、卒中、肝硬化等重要疾病及認知或精神異常。(2)對照納入標準：所有對象要求在招募地居住時間在10年或以上，年齡大于20歲。本研究獲遵義醫學院倫理委員會倫理同意書，所有研究對象于調查前均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1現場調查 問卷調查由經過統一培訓的調查員面對面詢問完成，調查內容由4部分構成，一般人口學資料包括年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化程度和經濟收入等；生活方式如吸煙、飲酒、飲茶和鍛煉；氟中毒相關情況調查包括爐灶是否改良、燃料類型、是否爐火燒烤食物及食用前是否淘洗等；膳食調查包括主食、蔬菜水果、肉類等。

1.2.2基因組分型 調查當天采用乙二胺四乙酸抗凝管采集研究對象的外周靜脈血 5 mL，-70 ℃保存備用。采用天根全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA。基因分型用高通量TaqMan-MGB RT-PCT技術進行檢測。基因分型使用Roche LightCycler480 Software實時熒光定量PCR儀(羅氏，瑞士)。PCR反應體系為6 μL:2×TaqMan通用PCR混合物0.25 μL，20×單核苷酸多態性(SNP)基因分型混合物0.25 μL，ddH2O 4.5 μL，DNA 1 μL。PCR反應條件為95 ℃ 4 min；95 ℃ 7 s，60 ℃ 40 s，40個循環。每個96孔板設置2個空白對照。用Roche LightCycler480 Software進行基因分型。

1.2.3尿氟檢測 現場調查時從每個對象留取10 mL尿液存于-70 ℃保存備用。采用離子選擇電極來測尿氟含量，儀器HQ40d Portable Meter (Hach,USA)，吸取1 mL尿液與24 mL去離子水混合，加入氟化物調節緩沖粉，然后用測得的值通過相應的比例算出每名參與者尿氟水平，根據WS/T 256-2005標準，正常尿氟值濃度低于1.6 mg/L。

1.2.4質量控制 數據采用Epidata3.0軟件進行雙人錄入并核對，膳食問卷采用食物模型輔助調查，研究對象的診斷采用統一標準由同一人完成。兩人分別采用盲法判斷基因型，隨機抽取5%的實驗樣品進行重復分型，結果一致率為100%，對無法自動分型的樣品，進行重復檢測，剔除重復檢測仍無法分型的樣品。

2 結 果

2.1一般情況 本次研究共收集氟骨癥195例，對照組195例。病例組平均年齡為(49.86±12.67)歲，女性占48.20%；對照組平均年齡(46.68±14.35)歲，女性占58.97%，兩組年齡和性別差異有統計學意義(P<0.05)。病例組rs662 位點基因型GG、GA和AA分布頻率分別為48.21%、46.15%、5.64%，而對照組的頻率分布分別是44.10%、42.56%、13.34%，差異有統計學意義(P<0.05)。經檢驗，rs662位點基因型頻率分布符合Hardy-Weinbery平衡定律(χ2=0.695，P=0.405)。此外，病例組與對照組之間在尿氟水平、民族、婚姻、文化程度、爐灶改良、烘烤糧食、使用燃料類型方面差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2rs662位點不同遺傳模式與氟骨癥的關系 將rs662位點基因型分成5種不同的遺傳模式，單因素分析發現，共顯性模式、顯性模式和累加模式與氟骨癥有關，校正年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化程度、吸煙、飲酒、飲茶、改良爐灶、使用燃料種類、烘烤糧食、尿氟及鈣攝入水平后，這種關聯仍然存在。rs662 AA基因型攜帶者較GG基因型攜帶者氟骨癥風險降低62%(OR=0.38,95%CI:0.15～0.95)； GG+AG攜帶者患氟骨癥風險是AA攜帶者的2.49倍(OR=2.49，95%CI:1.04～6.01)； AG型攜帶者患氟骨癥風險是AA攜帶者的2.59倍(OR=2.59，95%CI:1.05～6.40)。見表2。

表1 研究對象基本特征

續表1 研究對象基本特征

表2 rs662位點單核苷酸多態性在病例組與對照組分布情況及風險估計

a：未校正OR；b：校正年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化程度、吸煙、飲酒、飲茶、改良爐灶、使用燃料種類、烘烤糧食、尿氟及鈣攝入水平

表3 rs662位點單核苷酸多態性與性別、民族、尿氟及鈣攝入水平的關系(n)

膳食鈣攝入水平中位數：475 mg/d

2.3rs662位點單核苷酸多態性與性別、民族、尿氟及鈣攝入水平的關系 rs662位點基因型頻率在漢族、少數民族之間分布不同，存在民族差異，漢族AA型比例明顯高于少數民族(P<0.05)；此外正常尿氟水平與高尿氟水平之間基因型分布存在明顯差異(P<0.05)。而基因型頻率分布不存在性別差異(P>0.05)，不同基因型的膳食鈣攝入水平無明顯不同(P>0.05)。見表3。

2.4rs662位點單核苷酸多態性與性別、民族、尿氟及鈣攝入水平交互作用 將性別、民族、尿氟和鈣攝入水平進行分層分析，多因素Logistic回歸顯示正常尿氟水平時AG+AA基因攜帶者對氟骨癥具有保護

表4 rs662位點單核苷酸多態性與性別、民族、尿氟及鈣攝入水平交互作用分析

a：未校正OR；b：校正年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化程度、吸煙、飲酒、飲茶、改良爐灶、使用燃料種類、烘烤糧食、尿氟及鈣攝入水平

作用，而較高尿氟水平則沒有，rs662位點基因多態性與尿氟存在交互作用(P<0.05)；此外發現漢族人群AG+AA基因攜帶者對氟骨癥具有保護作用，而少數民族沒有，rs662位點基因多態性與民族存在交互作用(P<0.05)。未發現rs662位點單核苷酸多態性與性別和民族水平存在交互作用(P>0.05)。見表4。

3 討 論

氟骨癥是異常大量的氟化物積聚骨組織中的一種慢性代謝性骨病，以成骨活躍和骨轉換加速為病理基礎，包括骨硬化、骨軟化、骨質疏松、骨周軟組織骨化，以及軟骨和關節退行性改變[11-12]。氧化應激被認為是氟骨癥發生的重要機制[5-6]。有研究證實氧化應激相關基因多態性與氟中毒發生有關，如髓過氧化物酶基因[13]。PON1通過水解脂質過氧化物來減緩脂質過氧化，而且可降低氧自由基的積累，特別是脂質氫過氧化物[14]。但PON1基因多態性與氟中毒關系的研究還少見報道。本研究發現，共顯性模式AA型攜帶者患氟骨癥風險較GG型攜帶者顯著降低，而GG+AG及AG攜帶者患氟骨癥風險明顯高于AA基因型攜帶者，提示PON1 rs662 基因多態性與氟骨癥的風險相關。此前多項研究表明PON1基因多態性與骨健康有關。YAMADA等[7]發現，PON1 rs662單核苷酸多態性與日本老年女性骨密度有關，從而具有更高的骨質疏松風險。此外有研究也證實，PON1基因多態性與骨質疏松存在關聯[14-15]。越來越多的證據表明，脂質氧化和骨骼生物學之間存在生化關系，增加的脂質氧化引起氧化應激并減少Wnt信號，從而減少成骨細胞的分化和存活，通過cAMP介導的途徑誘導破骨細胞分化[16]。MACKINNON等[17]發現PON1基因多態性與多個骨轉換標志物有關，PON1可催化分解過氧化物，減少脂質過氧化產物的積累，降低氧化應激對骨形成的影響。雖然PON1可以通過參與脂質氧化來影響骨代謝，但確切的機制還需要進一步研究證實。

本研究發現，rs662基因頻率在漢族與少數民族分布之間存在差異，且民族差異修飾rs662單核苷酸多態性與氟骨癥之間的關聯。杜靜靜[18]研究表明rs662基因型頻率在漢族和維吾爾族的分布存在明顯差異。也有研究發現PON1基因多態性與日本人骨密度存在關聯[7]，而未在韓國人群發現此關聯[14]。有關該基因多態性與卒中風險的meta分析也證實該基因多態性存在種族差異，亞洲人GG+AG攜帶者缺血性卒中風險顯著增加，而高加索人則無影響[19]，在與糖尿病的關聯中也有類似發現，本研究結果與此相似。此外，本研究發現，rs662基因型在尿氟是否正常的患者間分布存在明顯差異，進一步分層分析也發現該基因多態性與尿氟存在交互作用，提示基因與環境存在交互影響。高尿氟水平反映氟暴露水平較高，可能在高氟環境暴露下，PON1的氧化應激調節作用已失控，導致其失去保護作用，但需要進一步研究證明。

綜上所述，PON1 rs662位點單核苷酸多態性與氟骨癥發生有關，且民族和氟暴露水平修飾該基因多態性與氟骨癥的關聯。這在一定程度上，為探索氟中毒個體化預防提供了理論依據和參考。由于本研究沒有測定PON1活性，尚不確定PON1活性是否受多態性影響。本研究樣本量相對較小，rs662位點單核苷酸多態性與氟骨癥的關系還需要進一步擴大樣本量進行研究驗證，rs662位點單核苷酸多態性在氟骨癥機制中的具體作用還需進一步深入研究。