SL7207/pBud-VP3-IL-24的腫瘤靶向性及其對胃癌細胞免疫作用研究*

曹紅丹，呂 琳

(1.重慶醫藥高等?？茖W校護理學院 401331；2.重慶醫科大學附屬第二醫院消化內科 400010)

減毒沙門菌是一種常見的侵襲性胞內菌，以它作為基因治療的載體,可以將外源DNA運送至真核細胞并在其中表達,被廣泛應用于腫瘤治療及抗腫瘤藥物研究[1]。此外，它可選擇性地聚集到實體腫瘤內，并能明顯延緩多種腫瘤包括黑色素瘤、結腸癌、肺癌和乳腺癌等的生長[2-3]。目前研究顯示，減毒沙門菌在體外抗腫瘤實驗及動物模型實驗中均取得了較滿意的治療效果[4]。臨床試驗證實，其具有較高的腫瘤靶向性和安全性[5]。

本課題組在前期工作中構建了基于白細胞介素-24(IL-24)的減毒沙門菌載體(命名為SL7207/pBud-VP3-IL-24),發現其對胃癌腫瘤細胞生長具有抑制作用[6]。本研究主要對其在小鼠體內分布情況及抗腫瘤免疫作用機制進行分析,以進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 減毒沙門菌載體 SL7207/pBud-VP3-IL-24(含EGFP)前期已構建。減毒沙門菌SL7207、大腸桿菌DH5a、MFC小鼠胃癌細胞、YAC-1小鼠淋巴瘤細胞株由重慶醫科大學附屬第一醫院腫瘤分子與表觀遺傳實驗室惠贈； 6～8周齡無特殊病原菌(SPF)級Balb/c雌性小鼠，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。RPMI1640培養液、新生牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.25%胰酶、博萊霉素(Zeocin)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Gibco和Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1荷瘤小鼠模型的建立及治療 將對數生長期胃癌細胞系MFC，制備胃癌細胞懸液，用生理鹽水將細胞濃度調至1×107個/mL，取清潔級健康小鼠90只，體質量(20±1)g，無菌環境下，在每只小鼠右側腋窩皮下以0.1 mL注射胃癌細胞懸液。接種第8天，以皮下腫瘤直徑大于0.5 cm為成瘤標準。將小鼠分為3組，即A組為 SL7207/pBud-Vp3-IL-24;B組為SL7207/pBud；C組為對照組,每組30只。將SL7207/pBud 、SL7207/pBud-VP3-IL-24菌液接種于含Zeocin的LB培養液中培養，至對數生長晚期時，測600 nm處吸光度值(A600)=0.6時收集菌體,用生理鹽水調整細菌為1×107cfu/mL。A、B組小鼠用3%碳酸氫鈉中和胃酸后，利用胃管口服飼喂相應細菌0.1 mL，每周1次，共服2次，C組口服飼喂等量生理鹽水。

1.2.2組織勻漿菌落計數 在治療后第7、14、21天分別將A組小鼠3只脫頸處死，無菌分離肝、脾、腎臟、心臟、胃和腫瘤，以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，稱重，然后以1∶5 的比例(1 g 組織∶5 mL培養液) 加入LB培養液，玻璃勻漿器中勻漿。將勻漿液按100倍比稀釋(×100)。參照文獻[7]，取100 μL 稀釋液接種到10 cm 的LB瓊脂平板上，37 ℃溫箱內倒置培養過夜，然后直接計數平板上的細菌菌落數。每克組織內的細菌數=菌落數×103×100(稀釋倍數)。

1.2.3免疫熒光顯微鏡和腫瘤組織病理形態學觀察 在A組治療后，采用上述方法無菌剝離瘤體組織和分離肝、脾、腎、心臟、胃，制作冰凍切片，熒光顯微鏡下檢測VP3-EGFP融合蛋白表達狀況。制作石蠟切片,蘇木精-伊紅(HE)染色觀察各組織病理變化。

1.2.4RT-PCR半定量分析 Trizol法提取各組瘤體組織和器官中總RNA。紫外分光光度計測定260 nm處及280 nm處吸光度值(A260及A280)，分析RNA純度并調整濃度。反轉錄反應制備cDNA，以PCR產物進行IL-24基因片段擴增，擴增片段為530 bp,引物：上游引物P1 5 ′-CGA AGC TTA TGA ATT TTC AAC AGA GGC TG-3′，P2下游引物5′-CGGT CGA CCT AGA TTC AGA GCT TGT AG-3′,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參照基因，PCR擴增條件為：94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s延伸35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠圖像分析儀觀察拍照，并測定條帶積分吸光度(intergral A,IA)值，以待檢基因條帶與內參條帶GAPDH的IA比值作為目的基因相對表達量。

1.2.5淋巴細胞增殖實驗 3組小鼠治療后14 d，脫頸處死，無菌從小鼠取脾臟，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，PBS洗滌2次，用RPMI1640培養液調整細胞濃度至 1×106個/mL，制得脾淋巴細胞懸液。96孔培養板每孔加入150 μL脾淋巴細胞懸液，繼而加入經RPMI1640完全培養液配制的刀豆蛋白A(ConA)100 μL(終濃度5 μg/mL)，每實驗組設5個復孔，置37 ℃，5% CO2飽和濕度條件下培養72 h。培養結束前4 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，繼續培養4 h。培養結束后加二甲亞砜150 μL，在酶標儀570 nm處測定吸光度值(A)。

1.2.6乳酸脫氫酶(LDH)稀釋法檢測自然殺傷細胞(NK細胞)活性 采用上述方法分離獲得脾淋巴細胞，以0.83% Tris-NH4C1(pH=7.2)破除紅細胞，沒有黏附的淋巴細胞作為NK反應細胞。以小鼠淋巴瘤細胞(YAC-1)作為靶細胞檢測NK細胞活性。脾淋巴細胞 1×106個/孔和 YAC-1細胞 5×104個/孔(起始效應：靶細胞比值為20∶1)，同時設靶細胞自然釋放孔和最大釋放孔，每組5個平行孔，置37 ℃，5% CO2孵育2 h。1 000 r/min離心5 min。 吸取各孔上清液0.1 mL加至96孔板中，37 ℃，10 min。每孔再加入0.1 mL新配制的LDH底物溶液，室溫避光反應10～15 min，加入30 μL檸檬酸終止液終止酶促反應。在酶標儀490 nm處測定A值。NK細胞活性(%)=(反應孔A-自然釋放孔A)/(最大釋放孔A-自然釋放孔A)×100%。

1.2.7巨噬細胞吞噬功能測定(中性紅實驗) 每組選取3只體質量相近的6周齡昆明種小鼠，摘眼球放血，引頸處死。吸取腹腔灌洗液，收集到50 mL離心管，4 ℃、3 000 r/min離心10 min后，去上清液，加1 mL完全 RPMI1640培養基。計數細胞，并調節細胞密度到2×106個/mL，接種在96孔板(2×105個/mL) ，培養4 h，各孔加入0.075%中性紅(100 μL/孔)，5% CO2，培養箱37 ℃培養1 h，除去中性紅溶液，預熱D-Hanks液洗滌細胞3次(pH 7.2)。各孔加入100 μL裂解液,室溫靜止過液?；旌暇鶆蚝笥诿笜藘x上測定540 nm處的A值(A540),以A值表示巨噬細胞攝取中性紅的能力。

2 結 果

2.1減毒沙門菌SL7207 在小鼠體內分布 組織勻漿菌落計數表明，A組治療后7 d在小鼠胃、肝、脾和腫瘤組織發現有減毒沙門菌，其中胃組織比其他臟器和腫瘤組織細菌數量要多(P<0.05)； 第14天,細菌數目在胃組織內逐漸減少，腫瘤組織中逐漸增多； 到第21天，除了脾臟和胃有少許細菌分布外，其他正常組織內沒有觀察到細菌，腫瘤組織中細菌數量卻比其他組織明顯增多，腫瘤/脾臟的菌量最大比可達212∶1(圖1)。

圖1減毒沙門菌SL7207 在小鼠體內分布狀況

2.2Apoptin-EGFP和IL-24體內表達狀況 在A組治療后7 d,熒光顯微鏡下可見腫瘤組織有VP3融合綠色熒光蛋白(apoptin-EGFP) 表達，在腫瘤外其他臟器中脾臟和肝臟也發現了熒光蛋白的表達,但其他重要臟器，如心、胃、腎未發現。HE染色可見腫瘤組織經治療后，腫瘤組織有較多壞死區，細胞核溶解，其他臟器未見明顯異常改變(圖2、3)

RT-PCR檢測結果顯示，第7天在腫瘤組織有IL-24表達，隨著時間推移，其表達量逐漸增多，同時在免疫器官肝臟和脾臟也發現有表達，腫瘤組織內表達量顯著高于其他組織(P<0.05)，見圖4、5。

2.3SL7207/pBud-VP3-IL-24對小鼠脾淋巴細胞增殖功能及NK細胞殺傷活性的影響 與C組相比較,A組有較強的促進淋巴細胞增殖和 NK細胞殺傷活性的作用,各組之間差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

A：腫瘤組織;B：脾；C：肝； D：心

A：腫瘤組織;B：脾；C：肝； D：心

2.4SL7207/pBud-VP3-IL-24對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 巨噬細胞吞噬功能實驗結果顯示，A、B、C組A540值分別為0.49±0.10、0.38±0.02、0.12±0.01，SL7207/pBud-VP3-IL-24可顯著提高腹腔巨噬細胞的吞噬活性(P<0.05)。

圖5 IL-24在荷瘤小鼠不同組織中的表達

表1 小鼠脾淋巴細胞增殖功能及NK細胞殺傷活性的檢測

a：P<0.05,與C組相比

3 討 論

自從1893年COLEY等偶然發現癌癥患者術后感染厭氧菌能夠使病情好轉以來，厭氧菌在腫瘤治療中的作用逐漸引起研究者的興趣[7]。PAWELEK等[8]將減毒沙門菌YS72(pur-)及YS721(pur-,ilv-)等通過腹腔內注射途徑注入荷瘤C57B6小鼠體內，發現細菌能夠優先聚集在腫瘤組織中；腫瘤組織與正常組織細菌比例最大可達到1 000∶1，治療組小鼠腫瘤體積明顯縮小。此后，其他研究者利用靜脈、腹腔及瘤體注射也得到了相似結果[9]。這說明減毒沙門菌可靶向腫瘤組織并能夠抑制腫瘤細胞生長,有望成為抗癌治療中新型載體。

本研究結果顯示，SL7207在腫瘤組織中分布隨時間推移逐漸增多，到21 d腫瘤組織內細菌數量較其他組織明顯增多，這提示減毒沙門菌載體SL7207可以遠距離優先選擇性聚集到腫瘤組織。通過對其攜帶基因及其表達蛋白的組織定位分析也證實SL7207/pBud-VP3-IL-24在腫瘤組織表達要高于其他組織。對于其靶向性的解釋，筆者認為主要與作為厭氧菌的減毒沙門菌生物學特性及腫瘤組織的特殊環境有關。PAWELEK等[8]認為采用營養缺陷型菌株所需物質如芳香族氨基酸等在正常細胞中含量極少，不足以滿足細菌生長的營養需要；而在細胞不斷分裂的腫瘤“壞死區”處于相對乏氧的微環境，腫瘤細胞代謝旺盛，有大量中間產物可供細菌利用，能為厭氧菌的定植和繁殖提供條件。而其他研究者認為，腫瘤組織內不規則的血管和腫瘤組織間隙內的高壓能阻止粒細胞、抗體和補體等免疫成分隨血流進入腫瘤組織，故沙門菌從腫瘤組織被清除的效率和速度比正常組織低,因此能在該環境中定植生存[10]。此外，腫瘤組織內也有可能存在某些黏附分子，導致細菌對腫瘤細胞有趨向性。

在本研究中，發現除了腫瘤組織外，其他重要臟器，例如胃、脾、肝，也有減毒沙門菌聚集生長，這主要與給藥方式和機體對減毒菌免疫反應有關。具有侵襲力的減毒沙門菌經口服途徑飼喂后，可通過胃腸黏膜上皮途徑侵入宿主細胞[11]。動物胃腸道黏膜表面派伊爾結的濾泡上皮細胞中分布著微皺褶細胞(M細胞)，被腸上皮細胞緊緊包圍，通過口服的具有侵襲力的沙門菌在胃腸道能增殖侵襲M細胞并破壞M 細胞進入皮下組織，也可通過包圍M細胞進入皮下組織，從而在本研究中觀察到胃腸組織有沙門菌的存在。此外，派伊爾結淋巴細胞激活活化后，開始分化，并向肝、脾臟等淋巴組織遷移[12]，所以重要免疫臟器也有細菌及其攜帶蛋白的分布。

本研究對免疫細胞在腫瘤非特異性免疫調節中作用進行探討，結果顯示，SL7207/pBud-VP3-IL-24可激活淋巴細胞和巨噬細胞活性，顯著增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用來發揮抗腫瘤免疫作用。有研究發現，沙門菌通過感染腫瘤細胞，可以充當天然的免疫佐劑，菌體脂多糖成分能夠激活宿主免疫系統，刺激炎癥介質釋放、激活淋巴細胞而增強全身或局部免疫[13-14]。另外，作為目前為止發現的唯一細胞因子類抑癌基因，IL-24也發揮重要免疫調節功能。研究顯示， IL-24免疫過的C3H系小鼠脾細胞增殖活性增強，CD3+CD8+T細胞數目明顯增多，同時Thl細胞因子的表達水平升高，從而促進免疫系統激活來發揮抗腫瘤免疫功能[15]。結合本次研究，SL7207/pBud-VP3-IL-24與SL7207/pBud比，前者有較強的刺激免疫細胞作用，故SL7207/pBud-VP3-IL-24對腫瘤免疫調節作用可能與沙門菌和IL-24聯合作用的結果有關。

綜上所述，SL7207/pBud-VP3-IL-24能夠靶向胃癌組織,在腫瘤組織，優先表達其攜帶基因及蛋白，并能通過增強機體非特異性免疫功能來調節抗腫瘤免疫，這為進一步研究其抗腫瘤作用機制奠定了基礎。為優化該生物制劑治療腫瘤作用效果，將在后續研究中針對SL7207/pBud-VP3-IL-24作用途徑，例如口服、靜脈注射、瘤體注射等，進一步探討。