超聲波輔助提取石崖茶總黃酮工藝優化

王 仲，金琦芳，段振華

（賀州學院 食品與生物工程學院，廣西 賀州 542800）

石崖茶是山茶科楊桐屬亮葉楊桐（Adinandra nitida）嫩梢制成的代茶，在廣西多地有分布，民間用來消炎、解毒、殺菌、鎮痛等[1-2]。現代研究表明，石崖茶抗氧化能力優于普通綠茶，其中茶湯中黃酮化合物起到較大作用[3-4]。且石崖茶比普通茶葉咖啡因含量低，低至1.74%，可作為因咖啡因引起中樞神經興奮而失眠的飲茶人群良好的替代茶飲[5-6]。研究表明石崖茶中總黃酮含量可高達28.4%，是目前已知黃酮含量最高的植物，具有抗氧化[7-8]、清除自由基[9-10]、抗菌[8,11]、降血脂[12]、降血糖[13]和抗腫瘤[7,14]等保健和藥用價值。目前，石崖茶中黃酮類化合物成分鑒定和含量測定方法主要有液質聯用[15-16]、HPLC法[17]和UPLC法[18]等，雖然這些方法檢測結果精確度較高，但是對大型試驗儀器的依賴性大。本研究參考其他植物超聲波輔助乙醇浸提總黃酮工藝[19-20]，優化石崖茶總黃酮提取工藝，得出一種儀器要求簡單、提取效率高的總黃酮提取工藝，并比較廣西金秀、昭平和桂平地區石崖茶總黃酮含量，為進一步推廣和利用該優異植物資源提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為石崖茶春茶，產自金秀、桂平和昭平地區。

1.2 試驗方法

1.2.1 主要試劑和儀器

所有化學試劑均為分析純，蘆丁標準品（HPLC＞98%）購自合肥博美生物科技有限責任公司。主要儀器有722型分光光度計、循環水式真空泵、高速多功能粉碎機、電子天平、超聲波清洗器、電熱恒溫干燥箱、40目篩等。

1.2.2 總黃酮的測定

標準品溶液配制。精密稱取20.0 mg于120℃干燥至恒重的蘆丁標準品，加140 mL體積分數為70%的乙醇，微熱水浴使溶解，放置至室溫后，加70%的乙醇定容至200 mL，搖勻，制得0.1 mg/mL標準品溶液。

標準曲線制作。精密量取0.0 mL、10.0 mL、15.0 mL、20.0 mL、25.0 mL和30.0 mL標準品溶液于50 mL容量瓶中，用濃度為70%的乙醇溶液補充至30 mL。各精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，充分搖勻，靜止6 min后各精確加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，充分搖勻，靜止6 min后各加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，用濃度為70%的乙醇溶液定容至刻度，充分搖勻，靜置15 min后使用紫外分光光度計在510 nm處測量吸光度值，以吸光值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線（圖1）。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of tutin

總黃酮的測定。準確稱取石崖茶粉末1.0 g，以乙醇溶液為溶劑，經超聲波輔助提取，抽濾后取濾液備用。采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法測定總黃酮的吸光度值[21]，根據蘆丁標準曲線計算出總黃酮的含量。

1.2.3 單因素試驗

考察在乙醇濃度50%、超聲時間20 min和超聲溫度30℃條件下，不同料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60對總黃酮提取率的影響；考察在料液比1∶50、超聲時間20 min和超聲溫度30℃條件下，不同乙醇濃度50%、60%、70%、80%和90%對總黃酮提取率的影響；考察在乙醇濃度50%、料液比1∶50和超聲溫度30℃條件下，不同超聲時間10 min、20 min、30 min、40 min和50 min對總黃酮提取率的影響；考察在乙醇濃度50%、料液比1∶50和超聲時間20 min條件下，不同超聲溫度25℃、35℃、45℃、55℃和65℃對總黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行四因素三水平正交試驗L9（34）設計（表2），考察料液比（A）、乙醇濃度（B）、超聲時間（C）和超聲溫度（D）四因素對總黃酮提取率的影響。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for Adinandra nitida fl avonoids extraction

1.2.5 不同產地石崖茶總黃酮含量測定

采用最優提取方案測定并比較廣西金秀、桂平和昭平三個產地的石崖茶總黃酮含量。

1.3 數據處理

數據采用SPSS20.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對石崖茶總黃酮提取率的影響

由圖2可看出，隨著溶劑用量增大，石崖茶中總黃酮提取率增大，在料液比為1∶50時提取率最高，提取率為26.2%，繼續增加溶劑用量提取率呈下降趨勢；提取率下降可能是由于增大溶劑用量使相同超聲時間內黃酮提取的超聲輔助效果減弱，導致提取不充分。因此，確定1∶50作為單因素試驗中的最適料液比，并選取料液比1∶40、1∶50和1∶60這3個水平進行正交試驗。

圖2 料液比對石崖茶總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of Adinandra nitida fl avonoids

2.1.2 乙醇濃度對石崖茶總黃酮提取率的影響

由圖3可看出，乙醇濃度在50%～70%范圍內時，石崖茶總黃酮提取率隨乙醇濃度增大而增大，乙醇濃度為70%時，提取率達到最高（27.55%）；隨著乙醇濃度進一步增大，提取率呈現下降趨勢。因此，確定合適的乙醇濃度在70%左右，選取乙醇濃度60%、70%和80%這3個水平進行正交試驗。

圖3 乙醇濃度對石崖茶總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of Adinandra nitida fl avonoids

2.1.3 超聲時間對石崖茶總黃酮提取率的影響

由圖4可看出，超聲時間為30 min時，提取率最大，為27.76%；再延長超聲時間，提取率呈下降趨勢。分析認為，超聲時間對石崖茶總黃酮提取率有明顯影響，超聲時間短時，提取不充分；超聲時間過長，可能會使黃酮遭到破壞，使提取率呈現下降趨勢。因此，確定合適的超聲時間在30 min左右，后續試驗中選取超聲時間20 min、30 min和40 min這3個水平進行正交試驗。

圖4 超聲時間對石崖茶總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of Adinandra nitida fl avonoids

2.1.4 超聲溫度對石崖茶總黃酮提取率的影響

由圖5可以看出，溫度對提取率有較大的影響，隨著超聲溫度的升高，提取率先升高，然后降低，在55℃時提取率達到峰值（27.01%）。分析認為，可能是一些黃酮類物質在過高的溫度條件下會隨著溫度的繼續升高而被破壞，從而導致黃酮的提取率降低。因此，確定合適的超聲溫度在55℃左右，后續試驗中選取超聲溫度45℃、55℃和65℃這3個水平進行正交試驗。

圖5 超聲溫度對石崖茶總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield ofAdinandra nitida fl avonoids

2.2 正交試驗結果

由表2極差分析結果可知，試驗考察的影響石崖茶總黃酮提取率的4個因素中，影響大小為：料液比＞超聲溫度＞超聲時間＞乙醇濃度。由各因素的極差及均值綜合分析可得，超聲輔助提取石崖茶總黃酮的最優提取方案應為A1D2C2B2，即料液比1∶40、乙醇濃度70%、超聲時間30 min和超聲溫度55℃。正交試驗中的試驗2恰為最佳方案因素組合，是正交試驗9組試驗中最好的結果。進一步根據最優方案進行驗證試驗，重復5次，得到石崖茶總黃酮平均提取率為30.32%，RSD=0.34%。結果表明，優化后的提取方案重復性好，提取率優化效果明顯。因此，本試驗優化方案可用于石崖茶總黃酮的提取。

表2 總黃酮提取率影響因素正交試驗結果Table 2 Flavonoids extraction rate factors orthogonal test results

2.3 不同產地石崖茶總黃酮含量比較

采用正交試驗優化后的提取方案，提取測定廣西昭平、桂平和金秀三個產區石崖茶產品的總黃酮含量。測定結果（圖6）表明，昭平、桂平和金秀石崖茶總黃酮含量存在差異，其中產自昭平的石崖茶總黃酮含量為30.4%，產自桂平的石崖茶總黃酮含量為27.4%，產自金秀的石崖茶總黃酮含量為25.6%。差異顯著性分析結果表明，不同產地來源的石崖茶總黃酮含量之間存在極顯著差異。

圖6 不同產地石崖茶總黃酮含量比較Fig. 6 Comparison of the total fl avonoids content of Adinandra nitida from different areas

3 結論

本試驗采用超聲波輔助提取石崖茶總黃酮，以石崖茶總黃酮提取率為指標，分別進行料液比、乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度4個因素對總黃酮提取率影響的研究。在單因素試驗的基礎上，進行正交試驗，分析得出石崖茶總黃酮的超聲波輔助提取工藝中4個因素對石崖茶總黃酮提取率影響大小為：料液比＞超聲溫度＞超聲時間＞乙醇濃度，提取工藝最優條件為：料液比1∶40、乙醇濃度70%、超聲時間30 min、超聲溫度55℃。該石崖茶總黃酮提取工藝具有提取率高、提取時間短及操作簡單方便等優點。通過比較昭平、桂平和金秀三個產地的石崖茶總黃酮含量，其中昭平的含量最高，具有潛在的推廣種植與開發利用優勢。