黃曲霉毒素B族和G族高效液相柱后衍生檢測方法的研究*

金慧慧

（溫州市龍灣區(qū)疾病預(yù)防控制中心，浙江溫州 325024）

作為真菌毒素重要代表的黃曲霉毒素，是至今為止發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素，是世界公認(rèn)的3大強(qiáng)致癌物質(zhì)之一，已被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為IA級(jí)危險(xiǎn)物，對(duì)肝臟影響最大，并有致畸、致突變、致癌的作用。天然產(chǎn)生的黃曲霉毒素根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同分為B1、B2、G1、G24種。隨著老百姓對(duì)食品安全關(guān)注度的不斷提高，保證食品質(zhì)量安全變得尤為重要。黃曲霉毒素污染食品的種類繁多，為了適應(yīng)不同的檢測目的和要求，黃曲霉檢測的新方法、新手段也隨之快速改進(jìn)。目前，黃曲霉毒素B族和G族的檢測方法主要為GB/T 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》。本文采用的是第三法 高效液相色譜-柱后衍生法中的柱后碘衍生法。經(jīng)過多次測定不同類別的樣品，發(fā)現(xiàn)在均質(zhì)步驟，目標(biāo)物損失較多，經(jīng)改變方法，通過2次均質(zhì)定容，均質(zhì)2次，第2次主要用于沖洗刀頭再合并均質(zhì)液以提高回收率，回收率在87.1%～123.1%之間。國標(biāo)上用內(nèi)徑4.6mm的C18柱需進(jìn)樣50μL，碘液濃度需要0.05%，碘液流速0.2mL/min，試劑浪費(fèi)嚴(yán)重，而且碘溶液易污染環(huán)境。此外對(duì)于需要多次測定同一樣品來計(jì)算RSD時(shí)，進(jìn)樣50μL可能導(dǎo)致樣品不夠而引發(fā)測量結(jié)果不準(zhǔn)確，現(xiàn)將色譜柱換成Waters Carbamate Analysis柱，進(jìn)樣量改為10μL，碘液濃度改為0.02%檢測進(jìn)樣，試驗(yàn)結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1、G1檢出限可達(dá)0.4 ng/mL，B2、G2檢出限可達(dá)0.2 ng/mL，此方法適用于花生醬、花生、大米等食品中黃曲霉毒素的測定。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters IClass型高效液相色譜儀，配有2475熒光檢測器；AL204電子天平，精度0.1mg；T25型均質(zhì)器，德國I K A公司。

1.2 試劑

黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2混標(biāo)，46300-USUP ELCO，含量為98%～99%，黃曲霉毒素B1和G1分別為0.932μg/mL和0.876μg/mL，黃曲霉毒素B2和G2分別為0.309mg/L和0.265mg/L，規(guī)格為每支1mL；免疫親和柱，Afla StarTMR，Romer Labs公司；甲醇，色譜純，莫克公司；水，超純水；碘，分析純。樣品來源于本科室所抽樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Carbamate Analysis柱，150mm×3.9mm；甲醇 + 乙腈 （1∶1）：水為 35∶65；激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm；流量：1.0mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL；衍生溶液：0.02%碘溶液。

2.2 樣品前處理方法

采取免疫親和層析法，該方法特異性強(qiáng)、凈化效果出色、操作簡單。稱取5 g左右研磨均勻的大米樣品于50mL離心管中，加入10mL（甲醇+水）（60+40） 均質(zhì)提取3min。另取一干凈50mL離心管，里面加入10mL（甲醇+水）（60+40） 沖洗刀頭，均質(zhì)3min，將此均質(zhì)液倒入初次均質(zhì)的離心管內(nèi)，合并均質(zhì)液，玻璃纖維濾紙過濾。取10mL濾液與20mL純水混合，備用。將50mL注射器筒與免疫親和柱頂部相連，將親和柱放置于固相萃取裝置上，移取15mL上述濾液稀釋液到注射器筒內(nèi)，放空親和柱柱內(nèi)液體，調(diào)節(jié)下滴速度，使液體以1～2滴/s速度過柱，待樣液流完后，加入20mL純水，以穩(wěn)定流速洗滌免疫親和柱，待柱內(nèi)液體被抽干后，在親和柱下面放置10mL刻度試管，然后用1.5mL甲醇分3次洗脫黃曲霉毒素，將洗脫液全部收集于10mL刻度試管中，整個(gè)洗脫時(shí)間不小于60 s。在50℃下氮吹吹至0.5mL以下，用甲醇定容至0.5 mL再用純水定容至1mL，漩渦30 s溶解殘留物，經(jīng)孔徑0.22μm濾膜過濾后待測。分別將標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)1（Std1）、標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)3（Std3） 平行測定6次，計(jì)算RSD。另取1份5 g左右均勻研磨大米樣品向內(nèi)加入0.002 5mL黃曲霉混標(biāo)制備加標(biāo)液1，取1份5 g左右均勻研磨大米樣品向內(nèi)加入0.025mL黃曲霉混標(biāo)制備加標(biāo)液2，同樣按上述樣品凈化步驟操作待測，計(jì)算加標(biāo)回收率。

2.3 色譜分析

高效液相色譜法結(jié)合熒光檢測器檢測黃曲霉毒素是國際上比較常用的方法。分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液及處理后的樣品進(jìn)行熒光分析，峰面積外標(biāo)法定量,計(jì)算樣品中黃曲霉毒素的含量。

2.4 試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 線性關(guān)系考察

以樣品黃曲霉毒素含量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1，回歸方程見表2。標(biāo)準(zhǔn)曲線Std1點(diǎn)色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Std1點(diǎn)色譜圖

表1 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線配制表

表2 黃曲霉毒素線性回歸方程

2.4.2 方法的檢出限、精密度和回收率

大米樣品本底圖譜見圖2。向空白本底樣品中分別加標(biāo)0.002 5mL、0.025mL黃曲霉混標(biāo)，黃曲霉毒素圖譜見圖3、圖4。加標(biāo)低于0.002 5mL黃曲霉混標(biāo)時(shí)得不到黃曲霉毒素的圖譜，因此將黃曲霉毒素 G2，G1，B2，B1方法檢出限分別定為 B1：0.4 ng/mL（0.406 ng/mL），B2：0.2 ng/mL（0.165 ng/mL），G1： 0.4 ng/mL （0.385 ng/mL） ， G2： 0.2 ng/mL（0.154 ng/mL）。黃曲霉素Std1、Std3平行測定6次其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～8.4%，結(jié)果分別見表3、表4。對(duì)樣品進(jìn)行高、低2個(gè)濃度的加標(biāo)試驗(yàn), 其加標(biāo)回收率在80.2%～116.2%，分別見表5、表6。

圖2 大米樣品本底圖譜

表3 黃曲霉毒素Std16次平行測定精密度

表4 黃曲霉毒素Std36次平行測定精密度

表5 黃曲霉毒素混標(biāo)原液加標(biāo)0.002 5m L回收率

圖3 黃曲霉毒素混標(biāo)原液加標(biāo)0.002 5m L圖譜

表6 黃曲霉毒素混標(biāo)原液加標(biāo)0.025m L回收率

圖4 黃曲霉毒素混標(biāo)原液加標(biāo)0.025m L圖譜

2.4.3 樣品測定

采用本方法共測定448份食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，其中加工堅(jiān)果類94份，五谷雜糧類270份，調(diào)料類50份，植物油34份。測定結(jié)果表明，30份花生醬中均檢出黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，22份花生米中檢出黃曲霉毒素B1、G1，5份葵花籽中檢出黃曲霉毒素B1、G2，13份玉米粉中檢出黃曲霉毒素B1、G2，6份大米均檢出黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，1份薏仁米均檢出黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，4 份小麥粉檢出黃曲霉毒素 B1、B2、G1，10份豆瓣醬檢出黃曲霉毒素B2，12份黃豆醬檢出B1，15份豆腐乳檢出黃曲霉毒素B1、B2、G1。

3 討論

該方法建立了用H P LC法檢測4種黃曲霉毒素的含量，該方法操作簡單，測定結(jié)果可靠，能夠完成對(duì)黃曲霉毒素的檢測。經(jīng)過多次測定不同類別的樣品，發(fā)現(xiàn)在均質(zhì)步驟，目標(biāo)物損失較多，經(jīng)改變方法，通過2次定容，均質(zhì)2次，第2次主要用于沖洗刀頭再合并均質(zhì)液以提高回收率，回收率在80.2%～116.2%之間。國標(biāo)上用內(nèi)徑4.6mm的C18柱需進(jìn)樣50μL，碘液濃度需要0.05%，碘液流速0.2mL/min，試劑浪費(fèi)嚴(yán)重，而且碘溶液易污染環(huán)境。此外對(duì)于需要多次測定同一樣品來計(jì)算RSD時(shí)，進(jìn)樣50μL可能導(dǎo)致樣品不夠而使測量結(jié)果不準(zhǔn)確，現(xiàn)將色譜柱換成Waters Carbamate Analysis柱，進(jìn)樣量改為10μL，碘液濃度改為0.02%檢測進(jìn)樣。試驗(yàn)結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1、G1檢出限可達(dá)0.4 ng/mL,黃曲霉毒素B2、G2檢出限可達(dá)0.2 ng/mL，此方法適用于花生醬、花生、大米等食品中黃曲霉毒素測定。