紅葉石楠中功能性紅色素的提取及純化工藝研究*

易思明 范曉越 董子鈺 王歲樓*

（中國藥科大學工學院，江蘇南京 211198）

紅葉石楠為薔薇科石楠屬雜交種的統稱，是常綠小喬木，其新梢和嫩葉為鮮紅色，有“紅衣衛士”“綠籬之王”的美稱。紅葉石楠的功能性色素成分之一為花色苷，是一類水溶性黃酮類物質，具有很多生理活性。目前國內對紅葉石楠的研究應用大多在培養繁殖技術、園林技術等方面，鮮有對其色素研究的報道。本文對紅葉石楠紅色素的提取及分離純化工藝進行初步研究，旨在為紅葉石楠的綜合利用及其功能性色素的開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

紅葉石楠葉，2017年5月采于中國藥科大學寧江校園第二食堂前。

無水乙醇、丙酮、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、鹽酸等，均為分析純試劑。

1.1.2 主要儀器與設備

DF Y-500高速中藥粉碎機；DZF-6050真空干燥箱；T U-1810型紫外可見分光光度計；K H-100B型超聲儀；R E-5205旋轉蒸發器；離心機；恒溫振蕩培養箱。

1.2 提取方法

將采摘的紅葉石楠葉清洗后，瀝干，放入烘烤箱內干燥24 h，取出后放入真空干燥箱內進一步干燥2 h。然后粉碎過篩（100目），得到紅葉石楠葉粉末。稱取1 g紅葉石楠葉粉末，加入一定料液比的提取劑，在一定溫度下超聲提取一定時間，在5 000 r/min條件下離心5min，離心后取上清液即為紅色素粗提液。按1.4所述方法，測定和計算提取液中花色苷總含量。

1.2.1 提取溶劑的選擇

稱取1 g紅葉石楠葉粉末,分別以蒸餾水、丙酮、乙酸乙酯、75%乙醇（加2%鹽酸）、無水乙醇（加2%鹽酸） 為提取劑，料液比 1∶30（g∶mL），40 ℃下超聲提取40min。

1.2.2 料液比提取選擇

稱取1 g紅葉石楠葉粉末各1 g，以75%乙醇為提取劑，在40℃下，分別以料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g∶mL） 超聲提取 40min。

1.2.3 提取時間的選擇

稱取1 g紅葉石楠葉粉末，以75%乙醇為提取劑，料液比為1∶30（g∶mL） 在40℃條件下超聲提取 20min、30min、40min、50min、60min。

1.2.4 提取溫度的選擇

稱取1 g紅葉石楠葉粉末，以75%乙醇，料液比為 1∶30（g∶mL），分別在 30 ℃、40 ℃、50 ℃、60℃、70℃下超聲提取40min。

1.2.5 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上,對乙醇體積分數、提取溫度、提取時間、料液比4個因素，采用L9（34）正交試驗，以確定最優提取方案。因素水平見表1。

表1 紅葉石楠紅色素提取的正交試驗因素及水平

1.3 純化方法

將活化后的硅膠與洗脫劑濕法裝柱，加入旋蒸后的紅色素粗提液，分別用石油醚-丙酮（9∶1）和丙酮沖洗至流出液無色，然后用一定體積分數的乙醇溶液以一定的流速解析，得到純化后的紅葉石楠紅色素溶液，在525 nm處測定吸光度，計算出純化液中花色苷總含量。

1.3.1 吸附溫度的選擇

將紅色素粗提液與硅膠在25℃、35℃、45℃條件下恒溫振蕩24 h。然后在525 nm處測得其吸光度。

1.3.2 上柱液量的選擇

分別加入1mL、2mL、3mL、4mL紅色素上柱液，分別用石油醚-丙酮（9∶1） 和丙酮沖洗至流出液無色，然后用50%乙醇溶液以1mL/min流速解析，測定流出液的吸光度。

1.3.3 洗脫劑濃度的選擇

分別加入2mL紅色素上柱液，分別用石油醚-丙酮（9∶1）和丙酮沖洗至流出液無色，然后分別用30%、40%、50%、60%乙醇以1mL/min流速解析，測定流出液的吸光度。

1.3.4 流速的選擇

分別加入2mL紅色素上柱液，分別用石油醚-丙酮（9∶1）和丙酮沖洗至流出液無色，然后分別用50%乙醇以 0.5 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min、2 mL/min流速解析，測定流出液的吸光度。

1.3.5 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，采用L9（33）正交試驗方法，對洗脫液乙醇濃度、上柱液體積、流速3因素做進一步優化，其因素及水平見表2。

表2 紅葉石楠紅色素純化的正交試驗因素及水平

1.4 測定方法

在波長525 nm處測定粗提液或者純化液的吸光度值，然后根據Fuleki公式計算出花色苷總含量：花色苷含量 （mg/100mL） =[(A U V-V IS-MAXA1700)1-(A U V-V IS-MAX-A1700)2]×M w×DF×10 000/ε，其中：1為pH=1.0時吸光度之差，2為pH=4.5時吸光度之差，DF為稀釋倍數。本試驗以矢車菊-3-葡萄糖苷作為標準物，其相對分子質量M w=449.2，摩爾消光系數ε=26900。

根據所添加的紅葉石楠葉片粉末的質量（mg）與稀釋體積（mL），可以換算為原料石楠葉中花色苷的提取率：

石楠葉花色苷提取率（W/W,%） =（提取液花色苷含量/葉片粉末質量/稀釋體積）×100%

2 結果與分析

2.1 提取試驗結果

2.1.1 單因素試驗結果

溶劑對紅葉石楠紅色素提取效果的影響見圖1。

圖1 溶劑對紅葉石楠紅色素提取效果的影響

由圖1可知，不同提取劑提取效果明顯不同，當提取劑為75%乙醇時，提取效果最好。

料液比對紅葉石楠紅色素提取效果的影響見圖2。

圖2 料液比對紅葉石楠紅色素提取效果的影響

由圖2可知，不同料液比對色素提取效果影響顯著，最佳料液比為1：20。

時間對紅葉石楠紅色素提取效果的影響見圖3。

由圖3可知，提取時間影響很大，最優提取時間為40min。當提取時間低于40min時，色素提取不完全，當提取時間超過40min時，可能導致其他物質溶解和擴散。

溫度對紅葉石楠紅色素提取效果的影響見圖4。

圖3 時間對紅葉石楠紅色素提取效果的影響

圖4 溫度對紅葉石楠紅色素提取效果的影響

由圖4可知，最優提取溫度為50℃。當溫度過低時，色素提取不完全，但溫度過高時，可能導致色素破壞。

2.1.2 正交試驗結果

紅葉石楠紅色素提取的正交實驗結果見表3。

表3 紅葉石楠紅色素提取的正交實驗結果

由表3可以看出，正交試驗中4個因素對紅葉石楠紅色素提取都有一定影響。比較極差R大小，可知各因素影響次序為：料液比＞提取時間＞乙醇濃度＞提取溫度；比較同一因素不同水平的結果，得知最優條件組合為A1B2C3D2，按此最優理論組合進行驗證試驗，結果與正交試驗中2號結果接近，因此選定2號的試驗條件A1B2C2D2為最佳提取方案：即提取溶劑為50%乙醇，料液比為1∶20（g∶mL），提取溫度為50℃，提取為40min，此時提取液中花色苷含量可達4.21mg/100mL，換算成葉片中總花色苷提取率（%） 為0.084 2。

2.2 純化試驗結果

2.2.1 單因素試驗結果

溫度對硅膠吸附性能的影響見圖5。

圖5 溫度對硅膠吸附性能的影響

由圖5可見，靜態吸附時溫度對硅膠性能影響不大，為了方便操作，選擇在室溫下進行。

上柱液量對紅葉石楠紅色素純化效果的影響見圖6。

圖6 上柱液量對紅葉石楠紅色素純化效果的影響

由圖6可見，當紅色素上柱液體積為3mL時，純化后的紅色素吸光度最大。隨著上柱液體積增大，吸光度變化不明顯，說明在紅色素上柱液體積為3mL時，硅膠吸附達到飽和，吸附劑不再吸附樣液。

洗脫劑濃度對紅葉石楠紅色素純化效果的影響見圖7。

圖7 洗脫劑濃度對紅葉石楠紅色素純化效果的影響

由圖7可見，當以50%乙醇作為洗脫劑時所測得的吸光度最大。

流速對紅葉石楠紅色素純化效果的影響見圖8。

圖8 流速對紅葉石楠紅色素純化效果的影響

由圖8可見，隨著流速的增加，紅色素的吸光度逐漸下降。

2.2.2 正交試驗結果

紅葉石楠紅色素純化的正交實驗結果見表4。

表4 紅色素純化的正交試驗結果

由表4可以看出，正交試驗中3個因素對紅葉石楠紅色素的純化效果都有一定的影響。比較極差R大小，可知各因素影響次序為：洗脫液濃度＞流速＞上柱液體積。比較同一因素不同水平的結果，得知最優條件組合為A2B1C2，此最優理論組合正好與正交試驗中4號試驗的條件組合一致。因此，選定A2B1C2為紅葉石楠紅色素純化的最佳工藝參數組合，即40%乙醇作洗脫劑，上柱液體積3mL，以1mL/min流速進行洗脫。

由以上最佳條件的試驗結果可以得出：純化倍數=(1.08/4.21)×10=2.57，其中1.08mg/100mL為純化后花色苷含量最大值，4.21mg/100mL為提取液花色苷含量最大值，10為稀釋倍數。

3 結論

紅葉石楠紅色素提取的最佳條件為：采用50%乙醇為提取劑，料液比1∶20（g∶mL），在50℃下提取40min，花色苷提取率可達0.084 2%。

紅色素粗提液純化的最佳工藝條件為：在室溫下，以硅膠作吸附劑，40%乙醇作洗脫劑，加樣量為3mL，以1mL/min流速進行洗脫，純化倍數可達2.57。

試驗結果表明，從紅葉石楠提取制備紅色素是可行性的，其提取與純化工藝條件值得進一步研究優化。