肝癌組織中血管內皮生長因子的表達水平及影響因素分析

范秀平，張春燕，李曉輝

(成都醫學院第一附屬醫院消化內科，四川 成都 610500)

肝癌是臨床常見惡性腫瘤，起病隱匿，進展速度快，惡性程度高，術后復發、轉移率高，預后差[1]。且肝癌屬典型多血管腫瘤，血管生成在肝癌發病及進展中有重要作用，同時也是引起肝癌轉移、復發的關鍵原因。血管內皮生長因子(VEGF)與肝癌血管生成相關度較高，可促進細胞增殖，引起內皮細胞分化，提升血管通透性，提升蛋白水解酶活性，促進腫瘤新生血管生成[2]。臨床研究發現，癌細胞VEGF信號轉導在腫瘤細胞生成、遷移及侵襲過程中有重要作用[3]。早期研究發現，乳腺癌、結直腸癌患者癌組織VEGF陽性率較高[4]，但目前對肝癌患者VEGF表達情況的變化及其機制少見報道。本文探討肝癌癌組織VEGF表達情況及其影響因素，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料2015年1月至2017年5月我院接受手術治療的80例肝癌患者，均經病理證實為肝癌，術前未接受放化療及介入治療。其中男51例，女39例；年齡39～79歲[(62.4±5.7)歲]；分化程度：高分化20例，中分化35例，低分化25例；肝癌TNM分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期44例，Ⅲ期27例；肝功能Child-Pugh分級：A級45例，B級35例；存在淋巴結轉移34例。并收集其中40例距肝癌組織2 cm以上癌旁組織標本，均經病理證實無腫瘤細胞浸潤，未見增生性病變。

1.2主要試劑與儀器鼠抗人VEGF免疫組化單克隆抗體、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑(均購自福州邁新生物技術開發有限公司)，四元羧酸乙二胺四乙酸(EDTA)組織抗原修復液(購自北京金橋生物科技有限公司)，免疫組化試劑盒(辣根過氧化物酶標記工作液、生物素標記通用型免疫蛋白G(IgG))(上海新肽生物科技有限公司)；Nikon YS100型光學顯微鏡(日本Nikon公司)，11-2R型電熱恒溫水浴箱(南京醫療器械廠)，RM2145型切片機(德國Leica公司)，電熱恒溫培養箱(上海醫療器械三公司)，TS-12C型自動脫水機(湖北電子儀器廠)，Z323K高速冷凍離心機(德國Hermle公司)。

1.3方法采用免疫組化法測定肝癌癌組織、癌旁組織VEGF表達。石蠟標本連續切片，厚度4 μm，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，PBS洗滌3次×3 min，3%過氧化氫孵育10 min，消除內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次×3 min，EDTA高壓修復2 min，室溫冷卻，PBS沖洗3次×3 min，動物血清封閉，室溫孵育10 min，滴入鼠抗人VEGF單克隆抗體，4 ℃低溫過夜，PBS沖洗3次×3 min，滴生物素標記IgG，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次×3 min，滴入DAB顯色液顯色，返藍10 min，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，清水沖洗，酒精分化，返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察染色情況。

1.4判斷標準VEGF陽性表達定位于細胞膜或細胞漿內，呈棕褐色顆粒。每張切片均選取5個高倍視野進行觀察，應用半定量積分法評定染色結果，著色強度：無著色為0分；黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽性細胞比例：低于5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。陽性細胞比例評分×著色強度評分為最終評分，陰性為0分；弱陽性為1～4分；中度陽性為5～8分；強陽性為9～12分。

1.5統計學方法采用SPSS 19.0軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗，相關分析采用Pearson相關性分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1肝癌組織與癌旁組織VEGF表達情況比較肝癌組織VEGF表達陽性率高于癌旁組織，且中度陽性、強陽性比例高于癌旁組織，弱陽性比例低于癌旁組織(P< 0.05)，見表1。肝癌組織VEGF陽性產物為棕褐色、淡黃色顆粒，主要表達于細胞漿內，呈彌散分布，在肝癌組織肝細胞索與血管內皮細胞內間隙肝竇細胞內呈弱表達，癌組織VEGF陽性分布及著色程度不均(圖1a)；癌旁組織VEFG表達水平較低，著色淺(圖1b)。

表1 肝癌組織與癌旁組織VEGF表達情況比較 [n(%)]

圖1 組織VEGF表達(HE×100) a:肺癌組織；b.癌旁組織

2.2不同臨床病理參數肝癌組織VEGF表達情況比較不同分化程度、不同TNM分期、不同肝功能分級、是否合并淋巴結轉移患者VEGF陽性率比較差異均有統計學意義(P< 0.05)，腫瘤低分化患者VEGF陽性率高于高分化者，高TNM分期、肝功能分級及合并淋巴結轉移的肝癌患者癌組織VEGF陽性率較高(P< 0.05)，見表2。

2.3肝癌組織VEGF表達與臨床病理參數的關系肝癌組織VEGF表達與腫瘤分化程度呈負相關，與TNM分期、肝功能分級、淋巴結轉移呈正相關，與淋巴結轉移相關度最高(P< 0.05)，見表3。

表2 不同臨床病理參數肝癌患者癌組織VEGF表達情況比較[n(%)]

表3 肝癌癌組織VEGF表達與臨床病理參數的關系

3 討論

肝癌起病隱匿，大部分患者發病初期均無特異性癥狀表現，確診時已進展至中晚期，部分發生淋巴結轉移或遠處轉移，手術根治效果差，術后復發率高[5，6]。而浸潤及轉移為惡性腫瘤的共同特點，是影響其預后的關鍵因素。而腫瘤浸潤及轉移過程通常受多因素影響[7]，明確其相關影響因素則可為患者預后改善奠定基礎。VEGF系特異性作用于血管內皮細胞的多功能的蛋白，可選擇性作用于血管內皮細胞膜絡氨酸激酶受體，加速內皮細胞有絲分裂，促進內皮細胞增殖及微血管形成，加快內皮細胞、單核細胞遷移速度，上調間質膠原酶、蛋白水解酶表達[8]。早期研究發現，卵巢癌、結腸癌、非小細胞肺癌患者均可見VEGF表達上調，提示VEGF在惡性腫瘤發病過程中有重要作用[9，10]。有學者發現，人肝細胞肝癌中VEGF及血管生成素均可促進腫瘤血管生成及腫瘤進展[11]。本研究發現，肝癌組織VEGF表達陽性率明顯高于癌旁組織，與熊建寧等[12]結論相符，提示肝癌發病過程中VEGF發揮重要的作用。血管生成是腫瘤生長、侵襲及轉移的基礎，血管生成可為腫瘤生長及增殖提供必要的營養支持，為癌細胞提供充足的血液供應，同時是促進腫瘤細胞擴散的重要途徑，可導致癌細胞血管滲透，促進其進入血循環，發生血行轉移。且VEGF可降解血管內皮細胞基質，削弱血管屏障作用，加重血管基底膜缺損，促進腫瘤轉移[13]。而肝癌為富血供腫瘤，其生長、增殖及轉移均有賴于VEGF的調控，細胞表面VEGF表達上調，腫瘤血管生成對肝癌生物學行為及侵襲性、增殖活躍性均產生重要的影響[14]。

本研究還發現，肝癌組織VEGF表達水平受腫瘤分化程度、肝癌TNM分期、肝功能分期及淋巴結轉移的影響，提示VEGF表達與肝癌生物學行為存在密切關聯，一般腫瘤分化程度越低，提示惡性程度高，腫瘤新生血管生成多，預后差。而肝癌TNM分期及肝功能分級越高的患者肝功能受損較為嚴重，腫瘤侵襲性越強，癌細胞生長速度快，可引起局部缺氧，導致癌細胞分泌大量VEGF，促進新生血管生成，造成癌細胞侵襲及轉移。此外，肝癌淋巴結轉移與淋巴管結構存在關聯，淋巴管管腔大，管壁薄，且不規則，當毛細淋巴外周組織受腫瘤侵犯時，淋巴管通透性提升，滲出增加，外周組織壓力上升，開放內皮細胞連接，導致癌細胞進入淋巴管，并向管腔內聚集，沿低阻區域蔓延、浸潤，導致淋巴結受累[15]。而VEGF主要表達于淋巴管內皮細胞內，對淋巴結管內皮細胞有較強的趨化作用，VEGF過度表達可促進內皮細胞增殖及淋巴管生成，直接引起腫瘤侵襲淋巴結并發生轉移[16]。此外，VEGF可于肝癌細胞膜受體結合，促進腫瘤增殖；同時其作用于癌細胞后可降低其間質粘附性，促使癌栓分離及脫落，導致腫瘤轉移。另外，VEGF可提升腫瘤血管通透性，促進血管內皮細胞釋放大量基質降解蛋白酶，降解細胞外基質，提升血管通透性，促進肝癌侵襲、轉移。

綜上，肝癌組織VEGF表達陽性率高，且其表達水平受病理因素的影響，包括腫瘤分化程度、TNM分期、肝功能分級及淋巴結轉移等，在肝癌侵襲及轉移過程中有重要作用。