拉米夫定和阿德福韋酯雙重耐藥HBV株臨床檢出特點與表型特性分析

陳容娟，劉　妍，李曉東，杜鳳霞，思蘭蘭，李　樂，許智慧，姚增濤，戴久增，徐東平，段昌柱

核苷（酸）類似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]是最主要的抗慢性HBV感染藥物。在我國，最早上市的拉米夫定（lamivudine, LAM）和阿德福韋酯（adefovir, ADV）仍被臨床廣泛應用。其中LAM具有較高的耐藥發生率（5年耐藥率為70%）[1]，且與ADV無交叉耐藥位點，因此臨床上積累了大量的LAM耐藥換用ADV單用或聯用進行挽救治療的慢性HBV感染者[2-3]。在長期LAM或ADV單藥序貫治療下，由于藥物壓力產生耐藥病毒，患者產生同時耐LAM和ADV的雙重耐藥HBV的幾率增加[4]，繼而發生病毒學和/或生化學突破，不僅加大臨床治療難度，同時其傳播風險也給公共衛生安全帶來了隱患[5]。目前，臨床上對HBV感染的LAM/ADV雙重耐藥譜尚缺乏全面的分析。在前期對我國患者多重耐藥HBV的研究基礎上[6-7]，本研究通過對我國臨床大樣本來源的慢性HBV感染者中LAM/ADV雙重耐藥HBV株的檢出率、病毒突變類型及突變病毒株演變和表型耐藥分析，以期為深入了解我國臨床流行的LAM/ADV雙重耐藥HBV感染特點提供參考，并為LAM/ADV雙重耐藥HBV感染的防治和挽救治療提供實驗依據。

1　對象和方法

1.1 對象與方法 研究對象為2007年7月—2015年12月在解放軍第三〇二醫院診治的26 553例慢性HBV感染患者，均接受相關的NAs治療。診斷標準符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》[8]，HBV DNA定量（2012年4月前臨床檢測下限為100 IU/ml，4月后為40 IU/ml）、血清生化學和免疫學常規檢查項目由解放軍第三〇二醫院臨床檢驗中心完成。無其他病毒重疊或混合感染，血清凍存于-20 ℃。

1.2 主要試劑 病毒DNA-OUT提取試劑盒（北京天恩澤公司），pGEM-Teasy載體（美國Promega公司），pTriEx-HBV（C）1.1倍載體（法國里昂大學Zoulim教授惠贈），恩替卡韋（entecavir,ETV）（中美上海施貴寶制藥有限公司），ADV（天津葛蘭素史克有限公司），替諾福韋酯（tenofovir,TDF）（美國吉利德公司）和實時熒光定量PCR試劑盒（上海復星公司）。引物合成和克隆測序均由北京天一輝遠公司完成。

1.3 方法

1.3.1 耐藥突變檢測分析 26 553例患者的血清樣本均采用本課題組創新建立的超靈敏巢式PCR方法（國家發明專利ZL 200910092331.1，檢測下限為10 IU/ml），進行HBV反轉錄酶（reversetranscriptase, RT）區耐藥突變檢測[9-10]。對PCR產物進行DNA雙向測序，應用DNASTAR Lasergene 7.1、Vector NTI Suite 8 對 rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236和rt250等與LAM、ADV或ETV相關耐藥位點[11]的序列峰圖進行分析。采用Mega 4軟件進行HBV基因分型。

1.3.2 基因克隆 將PCR產物連接至pGEM-Teasy載體中，每份樣本挑選至少20個陽性克隆測序并分析耐藥突變。

1.3.3 pTriEx-HBV1.1倍重組質粒構建 分別提取4種多重耐藥（multidrug-resistant, MDR）質粒及其對應的野生型克隆質粒，其RT區片段經XhoⅠ和SphⅠ雙酶切后定向克隆至pTriEx-HBV（C）1.1倍表達載體上，隨機挑取4個克隆對重組質粒進行測序鑒定，確定HBV表達質粒構建成功。

1.3.4 表型耐藥分析 將HepG2細胞接種于24孔板（1×105個/孔），18 h后每孔轉染0.25 μg質粒。5 h后，將細胞用1×PBS洗2遍，加入在含或不含 NAs（ETV+ADV/TDF/TDF+ETV，ADV、ETV、TDF 的濃度分別為 50、10、200 μmol/L）的 DMEM培養液，隔天換藥。4 d后收集細胞培養上清，用實時熒光定量PCR法檢測上清的HBV DNA，實驗獨立重復3次。

1.3.5 統計學處理 用描述性統計學方法進行描述，計算相應的頻數或率。連續變量呈正態分布或近似正態分布，用±s表示。

2　結　果

2.1 LAM/ADV雙重耐藥株檢出率及基因突變類型 對26 553例患者血清樣本HBV RT區PCR產物進行直接測序分析發現，LAM/ADV雙重耐藥HBV株的檢出率為0.6%（147/26 553），共檢出12種LAM/ADV雙重耐藥HBV株，其中主要突變類型為rtL180M+A181V+M204V（65.3%）、rtA181V+M204I（10.2%）、rtL180M+A181V+M204V+N236T（5.4%）和rtL180M+M204V+N236T（5.4%）（圖1）。

2.2 LAM/ADV雙重耐藥患者抗HBV用藥信息 147例LAM/ADV雙重耐藥患者臨床抗HBV用藥時間平均為63（36～151）個月，用藥方案復雜多樣，其中有60（40.8%）例患者經歷了LAM→ADV單藥序貫或聯合治療；57（38.8%）例患者經歷了LAM→ADV→ETV單藥序貫或聯合治療；12（8.2%）例患者經歷了替比夫定（telbivudine, LdT）→ADV單藥序貫或聯合治療。

圖1 LAM/ADV雙重耐藥HBV株突變類型Figure 1 Mutational patterns of LAM/ADV dual-drug resistant HBV mutants

2.3 代表性患者LAM/ADV雙重耐藥HBV株的動態演變 患者1應用LAM治療24個月無法獲得完全病毒學應答，換用LdT與ADV聯合治療，病毒仍無法被完全抑制，并在治療5個月（P1-1）時病毒突破至1.35×107IU/ml，病毒準種池中100%為rtA181V突變株；換用LAM與ADV聯合治療8個月（P1-2），病毒應答不佳，此時rtA181V突變株占42.11%，rtM204I突變株占5.26%，rtL80I+M204I突變株占42.11%，rtA181V+M204I占10.53%，原方案持續治療12個月，病毒仍為無應答狀態后更換為ETV+ADV聯合治療，治療12個月后獲得部分病毒學應答，但在第16個月（P1-3）時發生病毒學突破，HBV DNA為1.01×103IU/ml，此時病毒準種池中rtA181V突變株占31.58%，rtM204I突變株占5.26%，rtL80I+M204I突變株占57.89%，rtA181V+M204I占5.26%；ETV+ADV持續治療35個月（P1-4），此時病毒準種池中全部為rtA181V突變株；隨后病毒學發生部分應答，并在治療47個月后獲得完全病毒學應答（HBV DNA達到檢測不到水平），第50個月（P1-5）時，病毒準種池中均為野生型病毒株，直至治療第90個月，患者都處于完全病毒學應答狀態（HBV DNA持續檢測不到），并在第64個月（P1-6）和82個月（P1-7）時，均未檢出NAs耐藥相關突變（圖2A）。

患者2應用LAM治療應答不佳，發生病毒學和生化學突破，HBV DNA為1.41×106IU/ml，ALT為130 U/L，此時患者更換ADV進行挽救治療。在ADV挽救治療12個月，患者獲得了完全病毒學應 答，HBV DNA＜ 80.00 IU/ml，ALT為 27 U/L。但ADV持續治療第17個月（P2-1）時，再次發生病毒學突破，HBV DNA為1.01×104IU/ml，此時RT區克隆結果顯示病毒準種池中為100% 的rtN236T突變株。更換LdT治療3個月時獲得了部分病毒學應答，在LdT持續治療8～10個月時發生病毒學突破，并在第10個月（P2-2）時，病毒學突破至3.45×106IU/ml，此時病毒準種池全為rtL180M+A181V+M204V突變株；換用ETV治療9個月無法獲得完全病毒學應答后加用ADV聯合治療，在6個月后獲得完全病毒學應答，并持續67個月，HBV都處于完全病毒學應答狀態，且在ETV+ADV聯合挽救治療22個月（P2-3），未檢出NAs耐藥相關突變；ETV+ADV挽救治療82個月（P2-4）時，發生病毒學和生化學突破，HBV DNA 為 2.6×105IU/ml，ALT為 148 U/L，此時病毒準種池中rtL180M+M204V突變株占35.00%，rtL180M+S202G+M204V占65.00%；換用TDF治療6個月后獲得完全病毒學應答（圖2B）。

2.4 代表性LAM/ADV雙重耐藥突變株的復制力及表型耐藥特點分析 選取4種檢出率最高的LAM/ADV突變株構建至HBV 1.1倍基因組長HBV突變株和相應野生株重組復制子，其復制力測定結果顯示，與相應野生株相比，LAM/ADV突變株的復制力明顯降低。將野生株復制力設定為100%，rtA181V+M204I株、rtL180M+A181V+M204V株、rtL180M+M204V+N236T株和rtL180M+A181V+M204V+N236T株的復制力分別為相應野生株的37.5%、44.6%、52.0%和32.8%；體外強效NAs對4種突變株的抑制結果顯示：ETV+ADV、TDF和TDF+ETV均可有效抑制野生株復制，抑制率為98.5%～99.5%。 對于4種LAM/ADV雙重耐藥突變株，ETV+ADV、TDF和TDF+ETV也展示良好的抑制效果（抑制率分別為80.6%～92.5%、86.1%～97.9%和89.2%～97.5%），相對而言，TDF和TDF+ETV的抑制效果更好（表1）。

3　討　論

長期應用NAs抗HBV治療是限制或逆轉疾病進展的關鍵，但治療過程中產生病毒耐藥導致治療失敗的問題，使得抗HBV治療更加棘手[8，12-13]。耐藥病毒株是由藥物壓力下適應性強的突變病毒獲得選擇性擴增產生或直接通過耐藥株的水平傳播產生，且MDR HBV株對聯合治療的抗藥性更強[14-15]。對于LAM耐藥的慢性HBV感染者，指南推薦換用TDF或加用ADV挽救治療。在2014年以前，TDF未在中國批準用于抗HBV治療的情況下，LAM耐藥患者均采用加用ADV進行挽救治療，且聯合治療是預防MDR的有效方式[16]，但有少數患者仍會產生MDR[4]。

圖2 2例患者臨床信息和病毒學演變信息A.患者1血清生化學及病毒學演變信息；B.患者2血清生化學及病毒學演變信息Figure 2 Clinical information and virologic evolutions of 2 representative patients

表1 LAM/ADV耐藥突變株相對復制力及表型分析（±s，%）Table 1 Relative replication capacity and phenotypic characteristics of LAM/ADV resistant HBV strains(±s, %)

表1 LAM/ADV耐藥突變株相對復制力及表型分析（±s，%）Table 1 Relative replication capacity and phenotypic characteristics of LAM/ADV resistant HBV strains(±s, %)

突變形式 相對復制力 NAs對HBV DNA的抑制率ETV+ADV TDF TDF+ETV rt野生株 100 99.3 ± 3.2 98.5 ± 2.4 99.5 ± 4.0 rtA181V+M204I 37.5±2.5 83.8 ± 3.7 97.9 ± 1.3 97.1 ± 3.7 rtL180M+A181V+M204V 44.6±2.6 92.5 ± 4.6 97.6 ± 5.6 97.5 ± 4.0 rtL180M+M204V+N236T 52.0±3.2 80.6 ± 1.2 86.1 ± 2.0 89.2 ± 5.0 rtL180M+A181V+M204V+N236T 32.8±3.9 92.2 ± 5.2 96.9 ± 4.0 96.7 ± 5.2

本研究針對147例LAM/ADV雙重耐藥血清樣本進行回顧性分析，其中LAM/ADV雙重耐藥HBV株主要突變類型為rtL180M+A181V+M204V（65.3%）和rtA181V+M204I（10.2%）。患者臨床用藥方案顯示，40.8%的患者經歷了LAM→ADV單藥序貫或聯合治療；38.8%的患者經歷了LAM→ADV→ETV單藥序貫或聯合治療。許多患者在LAM耐藥后選擇低耐藥基因屏障藥物ADV或含有共同耐藥譜的ETV進行挽救治療情況較為常見，這些都使HBV發生MDR的風險增大。

對2例代表性LAM/ADV雙重耐藥患者的抗HBV治療過程進行分析，患者1是在LAM應答不佳后采用LdT+ADV挽救治療再換用LAM+ADV后仍應答不佳，此時患者血清病毒準種池中發現部分LAM/ADV雙重耐藥株與LAM耐藥株和ADV耐藥株并存。患者2在應用LAM應答不佳后，換用ADV單藥序貫治療發生病毒學突破再換用LdT單藥序貫治療再次發生病毒學突破，此時病毒耐藥檢測出LAM/ADV雙重耐藥病毒株。NAs應答不佳時再次選用低耐藥基因屏障的NAs藥物進行單藥隨意序貫、頻繁換藥或加藥等也增加了MDR發生的可能性[17]。

在發生MDR突變時，指南推薦ETV+TDF或ETV+ADV挽救治療[8]。TDF未在中國上市前，ETV+ADV是發生MDR患者的最優挽救治療方案。患者1和患者2在發生雙重耐藥突變后采用ETV+ADV挽救治療，均在3年后獲得完全病毒學和生化學應答。對2例LAM/ADV雙重耐藥患者在應用ETV+ADV挽救治療后動態血清克隆為雙重耐藥株消失，病毒準種池中為單一NAs耐藥株或隨著獲得完全病毒學應答時間的延長，病毒準種池中優勢株由單一耐藥株逐漸轉換為野生株，最后用本課題組超敏感的巢式PCR擴增專利方法也無法檢測出RT區耐藥基因。ETV+ADV是LAM/ADV雙重耐藥慢性HBV感染者的有效挽救治療選擇，但須密切監測肝功能和HBV DNA水平的變化，才能達到理想的治療效果。

TDF初始治療慢性HBV感染者8年數據顯示病毒學應答率良好，并未檢測到TDF相關耐藥突變[18]。另外TDF在治療NAs經治后發生單一NAs耐藥或MDR的患者都表現出較高的病毒學應答率，且耐受性良好[19-20]。患者2在應用ETV+ADV挽救治療6年后發生病毒學和生化學突破，此時病毒準種池中主要為ETV耐藥株與LAM耐藥株并存，換用TDF治療6個月后，獲得完全病毒學應答，TDF是ETV+ADV聯合治療效果應答不佳的有效選擇，本研究的體外表型結果與此相一致。4種LAM/ADV突變株體外表型結果顯示ETV+ADV、TDF和TDF+ETV均能有效抑制病毒復制，并且TDF和TDF+ETV的抑制效果更好。

總之，本研究通過臨床大樣本HBV耐藥分析，首次明確了LAM/ADV雙重耐藥的臨床發生特點，并對2例LAM/ADV雙重耐藥典型患者的樣本進行了HBV突變株產生特點及耐藥病毒在治療期間的演變進行了深入分析，結果顯示對于LAM耐藥患者選用低耐藥基因屏障藥物進行挽救治療更易發生MDR從而影響治療效果；ETV+ADV是LAM/ADV MDR患者有效的挽救治療方案，且獲得完全病毒學應答的時間越長，越有利于耐藥株為主向野生優勢株為主的轉變，從而恢復對多種NAs藥物的敏感性；對于MDR株，選擇高耐藥基因屏障藥物TDF或TDF+ETV挽救治療可以更快的獲得完全病毒學應答，這對于輔助臨床醫生在發現多重耐藥病毒株的HBV患者制定優化治療策略具有重要的指導意義。