細(xì)菌感染多重核酸檢測(cè)試劑參考品的建立

劉東來(lái)，周海衛(wèi)，石大偉，沈　舒，田亞賓，張春濤

細(xì)菌感染可以引發(fā)多種疾病，臨床上須要及時(shí)診斷。傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定基于培養(yǎng)法，是將患者體液標(biāo)本置于適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)增殖，然后鑒定培養(yǎng)物。但是，培養(yǎng)法對(duì)臨床樣本消耗量大且檢測(cè)周期長(zhǎng)，難以分辨多種細(xì)菌混合感染，以及很多致病性細(xì)菌難以分離培養(yǎng)等，導(dǎo)致傳統(tǒng)的鑒定方法有時(shí)不能滿足臨床診斷需求[1-2]。分子診斷技術(shù)檢測(cè)速度快，靈敏度、特異性和可重復(fù)性好，在突發(fā)性感染的評(píng)估，感染早期的發(fā)現(xiàn)、監(jiān)測(cè)以及細(xì)菌耐藥性分析等領(lǐng)域占據(jù)重要地位[3-5]。隨著分子診斷技術(shù)的快速發(fā)展以及臨床需求的不斷增加，多重核酸檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)是指在一個(gè)核酸檢測(cè)體系中加入多對(duì)擴(kuò)增引物，同時(shí)對(duì)多個(gè)病原體進(jìn)行靶向擴(kuò)增。通過(guò)與其他檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用，多重核酸檢測(cè)技術(shù)能夠同時(shí)對(duì)一份樣本檢測(cè)多種病原體并快速報(bào)告結(jié)果，該項(xiàng)技術(shù)正越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床診斷并受到廣泛關(guān)注[6-10]。常見(jiàn)的多重核酸檢測(cè)試劑的方法包括PCR、熔解曲線、等溫?cái)U(kuò)增以及第二代測(cè)序技術(shù)（又稱高通量測(cè)序或下一代測(cè)序技術(shù)）等[11-12]。目前，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)12個(gè)單次可檢測(cè)20余種細(xì)菌感染的多重核酸檢測(cè)試劑，檢測(cè)范圍覆蓋中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液、呼吸道、腸道以及生殖道感染相關(guān)細(xì)菌[13]。我國(guó)的相關(guān)行業(yè)尚處于起步階段，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局僅批準(zhǔn)1個(gè)基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的細(xì)菌多重核酸檢測(cè)試劑。

參考品是相關(guān)試劑質(zhì)量評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)以及審評(píng)審批的重要依據(jù)[14-17]。為適應(yīng)細(xì)菌多重核酸檢測(cè)試劑的性能特點(diǎn)，須要建立創(chuàng)新性的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。本研究建立了細(xì)菌感染多重核酸檢測(cè)試劑參考品并制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 候選參考品來(lái)源 候選參考品包括28株細(xì)菌，分別是屎腸球菌ATCC 700221、肺炎鏈球菌ATCC BAA-255、粘質(zhì)沙雷氏菌ATCC 27137、大腸桿菌ATCC 43888、表皮葡萄球菌ATCC 12228、鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 9955、肺炎克雷伯菌BAA-1705、緩癥鏈球菌ATCC 15914、糞腸球菌ATCC 700802、產(chǎn)酸克雷伯菌ATCC 13182、化膿鏈球菌ATCC 19615、流感嗜血桿菌ATCC 10211、金黃色葡萄球菌ATCC BAA-1747、奇異變形桿菌ATCC 29906、無(wú)乳鏈球菌ATCC 13813、單核細(xì)胞增多李斯特菌ATCC 19115、陰溝腸桿菌ATCC 13047、銅綠假單胞菌ATCC 27853、腦膜炎奈瑟菌ATCC 43744、藤黃微球菌ATCC 49732、馬紅球菌ATCC 6939、格氏李斯特菌ATCC 700545、瓊氏不動(dòng)桿菌ATCC 17908、副流感嗜血桿菌ATCC 9796、干燥奈瑟菌ATCC 9913、熒光假單胞菌ATCC 13525、嗜水氣單胞菌ATCC 7966、嗜肺軍團(tuán)菌ATCC 33152；6株真菌分別是近平滑念珠菌ATCC 90875、葡萄牙假絲酵母ATCC 34449、熱帶假絲酵母ATCC 66029、克柔念珠菌ATCC 90878、光滑念珠菌ATCC 15545、白色念珠菌ATCC 10231。上述菌株均由本單位保存并提供。

1.1.2 儀器和試劑 細(xì)菌培養(yǎng)使用腦心浸液培養(yǎng)基、甘露醇瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、軍團(tuán)菌GVPC選擇瓊脂培養(yǎng)基；厭氧產(chǎn)氣袋。細(xì)菌鑒定使用革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡（VITEK2 GN）；革蘭陽(yáng)性細(xì)菌鑒定卡（VITEK2 GP）；奈瑟氏菌及嗜血桿菌鑒定卡（VITEK2 NH）；酵母菌鑒定卡（VITEK2 YST）；革蘭陰性細(xì)菌藥物敏感性（藥敏）鑒定卡（VITE2 ASTGN）；革蘭陽(yáng)性細(xì)菌藥敏鑒定卡（VITEK2 ASTGP）。上述培養(yǎng)基及鑒定卡均購(gòu)自梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。細(xì)菌生化鑒定使用的全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（VITEK2）由梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司提供。細(xì)菌全基因組測(cè)序驗(yàn)證應(yīng)用的第二代測(cè)序服務(wù)購(gòu)自華大基因。

候選參考品協(xié)作標(biāo)定使用的多重核酸檢測(cè)的商品化或自建試劑包括呼吸道病原菌核酸檢測(cè)試劑盒、致病性細(xì)菌核酸檢測(cè)試劑盒、侵襲性真菌核酸檢測(cè)試劑盒、血培養(yǎng)病原體及其耐藥基因檢測(cè)試劑盒、血流感染常見(jiàn)病原體檢測(cè)試劑盒和細(xì)菌感染檢測(cè)試劑盒，由博奧生物集團(tuán)有限公司、華大基因、卡尤迪生物科技（北京）有限公司以及梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)及鑒定 本單位保存的34株細(xì)菌和真菌均為凍干粉狀態(tài)。一般地，菌株先加入200 μl肉湯培養(yǎng)基復(fù)溶，混勻后劃線接種于合適的固體培養(yǎng)基平板，35 ℃孵育培養(yǎng)24～36 h。挑取單個(gè)菌落，置于35 ℃孵育培養(yǎng)24～36 h傳代培養(yǎng)。屎腸球菌和糞腸球菌培養(yǎng)使用腦心浸液培養(yǎng)基；金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌培養(yǎng)使用甘露醇瓊脂培養(yǎng)基；馬紅球菌、藤黃微球菌、熒光假單胞菌、嗜水氣單胞菌、近平滑念珠菌、葡萄牙假絲酵母、熱帶假絲酵母、克柔念珠菌、光滑念珠菌和白色念珠菌培養(yǎng)使用哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基；化膿鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌和陰溝腸桿菌培養(yǎng)使用哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基；單核細(xì)胞增多李斯特菌、格氏李斯特菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌和干燥奈瑟菌使用巧克力瓊脂培養(yǎng)基；鮑曼不動(dòng)桿菌、瓊氏不動(dòng)桿菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和粘質(zhì)沙雷氏菌培養(yǎng)使用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基；嗜肺軍團(tuán)菌使用軍團(tuán)菌GVPC選擇瓊脂培養(yǎng)基。須要注意的是：化膿鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、干燥奈瑟菌和嗜肺軍團(tuán)菌須要使用厭氧產(chǎn)氣袋進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，其中嗜肺軍團(tuán)菌生長(zhǎng)緩慢，須培養(yǎng)96～120 h。

菌株的鑒定使用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)及其配套鑒定卡，所有操作按照儀器及鑒定卡說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 菌株濃度測(cè)定 應(yīng)用梯度稀釋法對(duì)鑒定正確的菌株的菌落形成單位濃度進(jìn)行測(cè)定[18]。簡(jiǎn)單的，菌株重新劃線接種于合適的固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行培養(yǎng)。使用3 ml無(wú)菌生理鹽水沖洗固體培養(yǎng)基表面的菌落，并配制一定麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙海?xì)菌按照0.5 MCF約為1.0×108CFU/ml估算，真菌按照0.5 MCF約為1.0×106CFU/ml估算。將上述菌懸液按10倍梯度進(jìn)行稀釋，取100 μl稀釋液劃線接種于合適的固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24～36 h。選擇菌落數(shù)為30～300個(gè)的平板進(jìn)行人工計(jì)數(shù)并計(jì)算原始菌液的濃度。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次并計(jì)算平均值。

1.2.3 混合樣本制備及驗(yàn)證 將34株已知濃度的菌株進(jìn)行分組、混合，參考FDA頒布的病原體多重核酸檢測(cè)試劑指導(dǎo)原則[19-22]，WHO公布的第一代細(xì)菌混合參考品[23]，以及在美國(guó)批準(zhǔn)上市的相關(guān)試劑的臨床數(shù)據(jù)[24-25]，制定本參考品的混合原則。其中主要包括：同一混合樣本中的菌株數(shù)量不超過(guò)5株，其濃度應(yīng)盡量相近且避免全部為革蘭陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭陰性細(xì)菌或真菌[19-22]。混樣本中的菌株應(yīng)為較高濃度，細(xì)菌應(yīng)約為 1×108～ 1×109CFU/ml，真菌應(yīng)約為1×106～ 1×107CFU/ml。實(shí)驗(yàn)室操作應(yīng)避免交叉污染。

混合樣本制備完成后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。委托華大基因應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本中所有菌株的全基因組進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證混合樣本中菌株的組成及交叉污染情況。

1.2.4 協(xié)作標(biāo)定及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定 經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、濃度測(cè)定、混合及鑒定的混合樣本組成細(xì)菌性感染多重核酸檢測(cè)試劑候選參考品。協(xié)作標(biāo)定使用4家公司的7個(gè)檢測(cè)試劑（盲編為A～G），根據(jù)各自產(chǎn)品特點(diǎn)對(duì)候選參考品進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。所有參考品均封盲檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果匯總后再行揭盲。根據(jù)協(xié)作標(biāo)定的有效結(jié)果，最終確定參考品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取一套參考品置于室溫條件（約25 ℃）下進(jìn)行3次反復(fù)凍融處理，然后使用一種多重核酸試劑進(jìn)行檢測(cè)，并委托華大基因進(jìn)行測(cè)序。檢測(cè)結(jié)果與正常儲(chǔ)存（-20 ℃）的參考品進(jìn)行比較，以考核參考品的凍融穩(wěn)定性。此外，還將對(duì)參考品長(zhǎng)期穩(wěn)定性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，計(jì)劃每年2次。

2　結(jié)　果

2.1 參考品組成 本研究選擇34株臨床上可導(dǎo)致腦膜炎，敗血癥，呼吸道、腸道及生殖道等感染的致病性細(xì)菌和真菌。全部菌株經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定正確后并測(cè)定濃度，最后進(jìn)行分組混合。34株高濃度的細(xì)菌和真菌被分成7組（M1～M7），其中M1～M6分別包含5種病原體，M7包含4種病原體。此外，每個(gè)混合樣本中均含有革蘭陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭陰性細(xì)菌或真菌。參考品具體組成見(jiàn)表1。

表1 參考品組成Table 1 Composition of reference material

2.2 參考品驗(yàn)證 應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)，分別對(duì)混合參考品M1～M7中菌株的全基因組進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示M1中5種細(xì)菌的總序列占比為99.4%；M2～M5中5種細(xì)菌和真菌的總序列占比分別為：90.1%、99.0%、98.7%、98.7%、99.1%；M6中5種細(xì)菌的總序列占比為97.7%；M7中4種細(xì)菌和真菌的總序列占比為97.7%。分析測(cè)序結(jié)果，M1～M7中的細(xì)菌和真菌的組成與預(yù)期相符，且參考品特異性經(jīng)過(guò)驗(yàn)證不存在交叉反應(yīng)。

2.3 協(xié)作標(biāo)定及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定 參加協(xié)作標(biāo)定的7個(gè)試劑（試劑A～G）的檢測(cè)方法包括PCR-熔解曲線、等溫?cái)U(kuò)增和第二代測(cè)序技術(shù)。試劑A～C為基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的多重核酸檢測(cè)試劑，檢測(cè)范圍分別包括13種下呼吸道細(xì)菌、16種致病性細(xì)菌和16種侵襲性真菌；試劑D為基于PCR和熔解曲線技術(shù)的多重核酸檢測(cè)試劑，檢測(cè)為24種血流感染相關(guān)細(xì)菌和真菌；試劑E～G為基于第二代測(cè)序技術(shù)（包括華大基因、Illumina和賽默飛世爾公司的高通量測(cè)序平臺(tái)）的多重核酸檢測(cè)試劑，其中試劑E的為25種血流感染相關(guān)細(xì)菌和真菌，試劑F和G靶向性檢測(cè)細(xì)菌16S rRNA基因。

表2 參考品測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果Table 2 Results of reference materials sequencing

協(xié)作標(biāo)定結(jié)果見(jiàn)表3。試劑A檢測(cè)出9種細(xì)菌；試劑B檢測(cè)出15種細(xì)菌；試劑C檢測(cè)出5種真菌；試劑D和E均檢測(cè)出24種細(xì)菌和真菌；試劑F檢測(cè)出10種細(xì)菌；試劑G檢測(cè)出25種細(xì)菌。根據(jù)各試劑產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，試劑A～E對(duì)于檢測(cè)范圍內(nèi)的細(xì)菌和真菌均檢出，且不在檢測(cè)范圍內(nèi)的細(xì)菌和真菌均未檢出；試劑F和G未檢出的細(xì)菌數(shù)分別為18種和3種。

參考品M1～M7進(jìn)行10倍系列梯度稀釋后，分別使用試劑B、C和D檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。檢測(cè)原倍、10倍稀釋和100倍稀釋的M1～M7時(shí)，試劑B和D的檢測(cè)結(jié)果均符合預(yù)期，試劑C則未能檢測(cè)到100倍稀釋的M5中的近平滑念珠菌。檢測(cè)1000倍和10 000倍稀釋后的M1～M7時(shí)，試劑B、C和D未檢出的菌株數(shù)量均較多（數(shù)據(jù)未展示）。此外，參考品在各稀釋梯度均未發(fā)生交叉反應(yīng)。

表3 參考品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果Table 3 Results of collaboration study

2.4 參考品穩(wěn)定性 參考品M1～M7置于室溫條件（約25 ℃）下反復(fù)凍融3次處理后，與-20 ℃保存且未經(jīng)凍融處理的參考品均使用試劑D進(jìn)行檢測(cè)，參考品M3和M6進(jìn)行全基因組測(cè)序，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。分析結(jié)果顯示，反復(fù)凍融3次處理并未影響參考品的穩(wěn)定性。

表4 梯度稀釋參考品檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of detecting gradient dilution of reference material

3　討　論

多重核酸檢測(cè)技術(shù)在多重病原體診斷領(lǐng)域的應(yīng)用帶來(lái)了更好的時(shí)效性、準(zhǔn)確性以及靈敏度[8]。FDA不僅先后批準(zhǔn)了多個(gè)多重核酸診斷試劑產(chǎn)品，更重要的是其頒布的4個(gè)專項(xiàng)指導(dǎo)原則對(duì)此類試劑的發(fā)展具有重要指導(dǎo)意義，推動(dòng)了行業(yè)發(fā)展[13，19-22]。而目前我國(guó)仍缺少多重核酸診斷試劑相關(guān)的專項(xiàng)法規(guī)或指南。病原體核酸檢測(cè)試劑參考品是經(jīng)過(guò)鑒定的具有代表性的一系列臨床分離培養(yǎng)樣本或模擬樣本，按照特定組成形式建立的，是相關(guān)試劑質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的核心以及產(chǎn)品審評(píng)過(guò)程的重要依據(jù)之一[17]。傳統(tǒng)單一病原體核酸檢測(cè)試劑的參考品組成一般包括數(shù)個(gè)陽(yáng)性參考品、陰性參考品、重復(fù)性參考品以及最低檢出限參考品，用以全面評(píng)價(jià)試劑的準(zhǔn)確性、特異性、重復(fù)性和靈敏度等核心性能[14-16]。如按上述思路，以某個(gè)試劑的檢測(cè)能力為24種細(xì)菌為例，須要設(shè)置500余個(gè)參考品。基于數(shù)量龐大的參考品的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，不僅對(duì)于企業(yè)和監(jiān)管部門是沉重的負(fù)擔(dān)，更嚴(yán)重的是由于缺少混合形式的參考品，該評(píng)價(jià)體系不能針對(duì)多重核酸檢測(cè)試劑的技術(shù)特點(diǎn)進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。因此，美國(guó)監(jiān)管部門建議使用混合樣本評(píng)價(jià)多重核酸檢測(cè)試劑的性能[19-22]。

表5 穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果Table 5 Results of stability test

本研究建立的細(xì)菌感染多重核酸檢測(cè)試劑參考品，由7支混合參考品組成，包括了34株經(jīng)過(guò)鑒定和驗(yàn)證且濃度已知的致病性細(xì)菌和真菌。參考品制備完成后應(yīng)用不同試劑進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性符合率（即準(zhǔn)確性）應(yīng)為檢測(cè)經(jīng)稀釋（終濃度應(yīng)不低于1.0×105CFU/ml）的混合參考品M1～M7，在產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的病原菌均應(yīng)檢出，且與已知型別相符，不在產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的病原菌均不應(yīng)檢出；陰性符合率（即特異性）應(yīng)為檢測(cè)經(jīng)稀釋（終濃度應(yīng)不低于1.0×105CFU/ml）的混合參考品M1～M7，不在產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的病原菌均不應(yīng)檢出；重復(fù)性應(yīng)為檢測(cè)稀釋至低濃度（不高于產(chǎn)品宣稱最低檢出限的10倍）的混合參考品M1～M7，分別重復(fù)檢測(cè)10次，在產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的病原菌均應(yīng)檢出，且與已知型別相符，不在產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的病原菌均不應(yīng)檢出；最低檢出限應(yīng)為檢測(cè)經(jīng)10倍系列稀釋的混合參考品M1～M7，終濃度為產(chǎn)品宣稱的最低檢出限濃度及以上時(shí)，在產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的病原菌均應(yīng)檢出，且與已知型別相符，不在產(chǎn)品檢測(cè)范圍內(nèi)的病原菌均不應(yīng)檢出。本研究對(duì)參考品的凍融穩(wěn)定性進(jìn)行了詳細(xì)考察，但是仍缺少參考品長(zhǎng)期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，在后續(xù)研究中應(yīng)補(bǔ)充完整并持續(xù)監(jiān)測(cè)。

本參考品具有以下優(yōu)勢(shì)：一是能大幅減少參考品數(shù)量；二是能夠考察試劑對(duì)多個(gè)待測(cè)菌株的混合樣本的分辨率；三是能夠考察非待測(cè)菌株對(duì)待測(cè)菌株的干擾；四能夠考察樣本中高濃度背景核酸對(duì)低濃度待測(cè)核酸的干擾。然而作為第一代參考品，其所覆蓋的病原菌數(shù)量有限，后續(xù)換批、換代過(guò)程中應(yīng)考慮逐漸增加菌株數(shù)量并適當(dāng)提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。