監測核苷（酸）類抗HBV藥物治療CHB的停藥指標

劉璐潔，劉　妍，劉新光，徐東平

HBV持續復制是促進慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）進展的關鍵因素，核苷（酸）類似物（nucleoside/nucleotide analogues, NUCs）是當前臨床最常用的抗病毒治療藥物，其主要通過抑制病毒的反轉錄和DNA合成發揮抗病毒作用。積極的抗病毒治療能夠明顯延緩肝病進程，減少終末期肝病的發生，但由于NUCs不能完全清除肝組織內共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA），一旦停藥往往會發生病毒學反彈和疾病復發。因此，我國2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》[1]推薦長期抗病毒治療。長期甚至終生服藥往往使患者難以接受，影響依從性；巨額的藥費又給患者家庭和社會帶來沉重的經濟負擔，故有必要篩選并明確輔助評價抗HBV治療CHB患者停藥的新指標，提高成本效益的可行性。本文就近年來新的指導CHB患者停藥的指標，如肝組織HBV cccDNA、血清HBcrAg和血清HBV RNA等的研究進展進行綜述。

1　監測NUCs治療CHB患者停藥的傳統指標

目前，CHB患者診療評價的血清學標志物主要有HBsAg/抗 -HBs、HBeAg/抗 -HBe和抗-HBc等。其中抗-HBc主要是IgG型抗體，只要感染過HBV，無論病毒是否被清除，此抗體多為陽性。Hou等[2]在2015年的研究中提示，在接受聚乙二醇干擾素（pegylated interferons,Peg-IFN）治療的HBeAg陽性CHB患者中，基線抗-HBc定量≥30 000 IU/ml的患者具有更高的病毒學應答率、HBV DNA抑制率和肝炎復常率，提示基線抗-HBc水平可以預測Peg-IFN療效。2016年Fan等[3]進一步的研究顯示，在接受Peg-IFN和NUCs治療的2組HBeAg陽性CHB患者中，基線抗-HBc定量≥4.4 log10IU/ml（相當于30 000 IU/ml）及基線HBV DNA ＜9 log10copies/ml的患者具有更高的HBeAg血清學轉化率，2組分別為65.8%和37.1%，其中基線抗-HBc水平是HBeAg血清學轉化率的最佳獨立預測因子，在優化抗病毒治療中具有實用價值。

指南提出CHB患者治療的理想終點是HBeAg陽性和HBeAg陰性的患者停藥之后實現持久的HBsAg清除，伴或不伴HBsAg的血清學轉換[1]。CHB患者治療的滿意終點是HBeAg 陽性患者停藥后獲得持續的病毒學應答，ALT復常，并伴有HBeAg 血清學轉換；HBeAg 陰性患者停藥后獲得持續的病毒學應答和ALT 復常。CHB治療的基本終點是如果停藥后無法獲得持續應答，至少在抗病毒治療期間能夠長期維持病毒學應答。目前臨床上判斷CHB患者是否可以停藥的指標主要是持久的HBsAg清除以及停藥后獲得持續的病毒學應答。

血清HBsAg由肝內HBV cccDNA轉錄而來，其水平與肝內cccDNA的轉錄活性密切相關，清除血清HBsAg可以顯著降低CHB患者發生肝硬化和肝癌的風險[4]。但是，即使應用目前認為HBsAg陰轉率最高的Peg-IFN治療后，HBsAg陰轉率仍然很低；而NUCs治療后HBsAg陰轉率更低[5]。因此，提高血清HBsAg的陰轉率對CHB患者的治療有重要意義。目前許多學者致力于血清HBsAg清除的相關研究。Cornberg等[6]研究指出，在NUCs治療過程中，血清HBsAg快速下降至低水平與血清HBsAg的清除相關。Peng等[7]研究指出基線水平血清HBsAg＜3000 IU/ml且HBeAg陽性患者最初治療3個月和HBeAg陰性患者最初治療12個月時血清HBsAg下降≥基線的75%可以預測血清HBsAg陰轉。另外，血清HBsAg的基線水平和抗病毒治療結束時的水平可以預測HBV的復發[8]。

雖然血清HBsAg主要來自感染肝細胞核內的cccDNA，但越來越多的實驗結果提示，整合的HBV DNA片段也能轉錄翻譯產生HBsAg[9]。而最近的研究報道顯示，CHB患者肝細胞存在大量的整合HBV DNA片段，最高可有1%肝細胞帶有整合的病毒DNA片段，即患者最多可有上億肝細胞帶有整合病毒片段[10]。整合的病毒DNA片段的斷點多集中在病毒基因組DR1和DR2區域，而病毒的S基因區域多保持完整，具有轉錄產生HBsAg的潛能[11]。因此，血清中的HBsAg也可能來源于整合的HBV DNA片段。這可能是臨床上部分患者血清HBsAg難以清除的原因之一。

2　監測NUCs治療CHB患者停藥的新指標

2.1 肝組織HBV cccDNA

2.1.1 肝組織HBV cccDNA的定義 當HBV病毒顆粒（Dane顆粒）侵入肝細胞后，首先脫去包膜形成核衣殼，然后脫去衣殼，裸露出松弛環狀雙鏈DNA（relaxed circular DNA, rcDNA），進入肝細胞核內，在宿主酶的作用下，形成cccDNA；再以cccDNA為模板，轉錄成前基因組RNA（pregenome RNA, pgRNA）和幾種不同長度的mRNA。pgRNA在反轉錄酶的作用下，形成子代rcDNA，并在肝細胞質中裝配形成完整的HBV，釋放出肝細胞，進入血液；肝細胞質中的rcDNA也可再進入肝細胞核，再次形成cccDNA，繼續同樣的復制過程（見圖1）。cccDNA在HBV感染初期可被檢測到，且長期存在于細胞核中形成cccDNA池，對HBV的復制以及感染狀態的建立具有十分重要意義，它的長期存在是乙型肝炎慢性化的主要原因之一[12]。

圖1 肝組織HBV cccDNA、血清HBV RNA和血清HBcrAg形成過程示意圖Figure 1 Schematic diagram of the production of intrahepatic HBV cccDNA, serum HBV RNA and serum HBcrAg

2.1.2 肝組織HBV cccDNA的研究進展 肝組織HBV cccDNA的徹底清除是目前公認的CHB患者“治愈”的指征。由于現有的抗病毒治療藥物對cccDNA無法直接清除，停藥后往往發生高比例的病毒學反彈和疾病復發[13]。Wong等[14]發現CHB患者經過短期（24個月）NUCs治療后，可以明顯降低血清HBV DNA含量，血清HBsAg和肝組織HBV cccDNA水平也有下降但下降不明顯。該研究團隊繼續隨訪研究發現，隨著NUCs藥物治療時間的延長（126個月），可顯著降低肝組織HBV cccDNA含量，且該研究中有21例患者肝組織HBV cccDNA水平低于檢測下限[15]；另外，血清HBsAg水平也逐漸下降，但減少的程度遠沒有肝組織cccDNA下降的多。以上研究表明，經過長期抗病毒治療，可能清除肝組織HBV cccDNA。同時，也表明CHB患者經過長期NUCs治療后，肝組織cccDNA與血清HBsAg水平不相關（P=0.209）。

近年來，關于肝組織HBV cccDNA與血清HBV DNA的相關性存在不同的研究結果[16-17]。Li等[18]研究發現肝組織HBV cccDNA與血清HBV DNA的相關性受HBV感染時期的影響，其中免疫清除期和HBeAg陰性肝炎期的患者肝組織HBV cccDNA與血清HBV DNA水平相關。

總之，血清HBsAg和血清HBV DNA水平并不能完全代表肝組織HBV cccDNA水平，即使血清HBsAg和血清HBV DNA轉陰，肝組織內仍然可以檢測到HBV cccDNA[19]。因此，直接檢測肝組織內HBV cccDNA有助于真正了解病毒復制情況，只有清除了細胞核內的HBV cccDNA，才能徹底消除病毒攜帶狀態。肝組織內HBV cccDNA檢測可視為目前診斷CHB患者病情和判斷療效最有潛力和價值的指標，對評價藥物治療HBV的療效，幫助了解機體清除HBV的程度，為臨床醫生判斷停止抗病毒治療的時間及停止治療后HBV是否會重新復制導致乙型肝炎復發有重要意義[12]。

2.1.3 肝組織HBV cccDNA的應用局限性 由于檢測肝組織HBV cccDNA的含量須行肝組織活檢，因此在臨床工作中較難開展。本課題組與解放軍第三○二醫院病理診斷與研究中心合作，創建了CHB患者微量石蠟包埋肝組織HBV cccDNA定量檢測方法，該方法具有較好的特異度、靈敏度和穩定性。另外，該方法可利用臨床常規組織病理檢測后剩余的肝組織進行檢測，在一定程度上克服了檢測樣本來源受限的困難，同時有利于留存組織的回顧性研究[20]。

2.2 血清HBcrAg

2.2.1 血清HBcrAg的定義 HBcrAg是由前C/C區編碼的一系列蛋白，主要包括HBcAg、HBeAg和p22crAg。其中HBcAg存在于HBV顆粒的核心，是HBV的結構蛋白即病毒核殼蛋白；HBeAg是存在于血清中的可溶性肽，一般情況下，HBeAg埋藏于HBcAg內部，當HBcAg裂解時，HBeAg從肝細胞核內釋放入血清[21]；p22crAg存在于HBV DNA陰性的空Dane顆粒中，是包含從-28～150氨基酸序列的一種前核心蛋白，包括未剪切的信號序列但缺少C末端的精氨酸富集區域[22]（見圖1）。

2.2.2 血清HBcrAg的研究進展 Wong等[23]研究發現，在自然感染狀態下血清HBcrAg與肝內HBV cccDNA、肝內總HBV DNA和血清HBV DNA高 度 相 關（r=0.70，P＜0.0001；r=0.67，P＜ 0.0001；r =0.69，P＜0.0001）。經過長期NUCs抗病毒治療，血清HBcrAg下降的程度與肝組織cccDNA下降的程度具有可比性。同時，該研究者還發現當患者血清中HBV DNA陰性時，仍然可以檢測到HBcrAg，此時，血清HBcrAg水平與肝組織HBV cccDNA仍然有很好的相關性（r=0.42，P＜0.0001）。此結果表明血清HBcrAg是一個可靠的能替代肝組織HBV cccDNA的血清學標志物，它可以很敏感地反映肝組織HBV cccDNA的含量以及病毒的持續狀態。Maasoumy等[24]在研究感染A或D基因型HBV的歐洲人群時發現血清HBcrAg水平與血清HBsAg水平相關。近期，有報道指出：與血清HBsAg相比，血清HBcrAg更能體現與肝內HBV cccDNA的相關性[25]。以上均表明血清HBcrAg可能是一個令人滿意的肝內HBV cccDNA替代標志物，因此，在監測NUCs治療CHB患者停藥方面具有很好的應用前景。

近年來，許多研究都揭示了血清HBcrAg的臨床價值。Song等[26]討論了血清HBcrAg水平對HBeAg自發性血清學轉換的預測價值，提出血清HBcrAg水平的降低與HBeAg的血清學轉換有關。同時，血清HBcrAg水平也是鑒別拉米夫定停藥后復發危險性的一個有用的標志物，經拉米夫定治療后，非復發患者血清HBcrAg水平顯著低于復發患者[27]。除此之外，血清HBcrAg還可用于評估肝癌發生與復發的風險。Tada等[28]指出，沒有進行NUCs抗病毒治療的CHB患者，血清HBcrAg＞2.9 log10IU/ml可以預測肝癌的發生。經NUCs抗病毒治療的肝癌患者，血清HBcrAg水平具有預測肝癌復發的作用，Hosaka等[29]指出血清HBcrAg＞4.8 log10IU/ml是診斷肝癌再發生的獨立因素。

2.2.3 血清HBcrAg應用的局限性 目前，用于檢測血清HBcrAg的方法主要是化學發光酶免疫分析技術，這是一種同時檢測前C/C基因區編碼的HBcAg、HBeAg、p22crAg等3種蛋白抗原總體的技術[30]（見圖2）。但在檢測HBcrAg時，由于HBcAg和p22crAg分別存在于Dane顆粒和空的Dane顆粒中，所以在檢測前須先加開殼劑，使其釋放；并且對于抗-HBc或抗-HBe陽性的樣本，血清標本須經過預處理使HBeAg和HBcAg分別從患者自身的抗原-抗體復合物中釋放出來；最后，還須將抗原的立體結構打開成直線狀[31]。檢測血清HBcrAg的前處理過程較復雜，是其難以在臨床上推廣的主要原因。

2.3 血清HBV RNA

圖2 血清HBcrAg的檢測原理Figure 2 Detecting principle of serum HBcrAg

2.3.1 血清HBV RNA的定義 早在1996年K?ck 等[32]就在感染HBV患者的血清中發現了HBV RNA。然而一直以來，因具有感染性的、完整的Dane顆粒所攜帶的病毒基因組為帶有缺口的rcDNA，人們一直認為HBV為嗜肝DNA病毒屬的病毒，研究者對于自由存在于細胞外且在血液中循環的RNA的來源并不是很明確。近年來，有研究報道，在血清中檢測到的HBV RNA可能合并存在于HBV病毒顆粒中[33-34]。最近，Wang等[35]通過一系列實驗證明了血清中的HBV RNA來源于感染肝細胞內HBV cccDNA活性轉錄的3.5 kb的pgRNA，這些pgRNA未經反轉錄，由核衣殼和包膜包裹釋放入血液（見圖1）。

2.3.2 血清HBV RNA的研究進展 近年來，有研究報道稱基線血清HBV RNA水平可以預測IFN或NUCs對CHB患者的抗病毒效果[33]，并且同時監測血清HBV DNA和HBV RNA水平可預測NUCs治療后復發[36]。Wang等[35]通過小樣本回顧性臨床研究發現，停藥點血清HBV RNA未檢出的CHB患者發生停藥后病毒學反彈的風險明顯下降，并提出CHB患者血清HBV RNA水平可能反映肝內HBV cccDNA水平。當血清中檢測不到HBV RNA時，提示患者肝組織HBV cccDNA的消失或轉錄靜默，預示著可以安全停藥。最近Giersch等[37]初步驗證了血清HBV RNA可以作為反應肝內HBV cccDNA活動性的指標。該研究利用HBV感染小鼠，分別使用NUCs和Peg-IFN對小鼠進行抗病毒治療，測定治療前后血清HBV RNA、肝pgRNA及肝HBV cccDNA，結果表明：經NUCs治療4周后的小鼠血清HBV DNA水平下降，血清HBV RNA水平輕微的上升；而用Peg-IFN治療后血清HBV DNA和HBV RNA水平均下降。在經治及未經治療的HBV感染小鼠中，血清HBV RNA水平與肝內pgRNA水平均相關（r=0.82，P＜0.0001）；在未經治療的HBV感染小鼠，血清HBV RNA水平與肝內HBV cccDNA水平相關（r=0.89，P＜0.0001），表明血清pgRNA水平可以反應肝內HBV cccDNA的活動性。由于該實驗所用小鼠均為HBeAg陽性，所以對于血清HBeAg狀態是否影響血清HBV RNA與肝內HBV cccDNA的相關性仍須進一步研究。Wang等[38]研究表明血清HBeAg的狀態可能會對血清HBV RNA和肝內HBV cccDNA的相關性有潛在的影響。該研究分別對未經治療的HBeAg陽性或陰性患者血清HBV RNA與肝內HBV cccDNA的相關性進行了分析。結果顯示，在HBeAg陽性患者中，血清HBV RNA與肝內HBV cccDNA相關（r=0.39，P=0.002）；但對于HBeAg陰性患者，這種相關性并不存在（r=0.10，P=0.654）。同時還分析了接受NUCs治療患者的血清HBV RNA水平與肝內HBV cccDNA的相關性，這與Giersch的研究結果相似。經過治療后，血清HBV RNA水平與肝內cccDNA水平沒有相關性。但是卡方檢驗表明檢測血清HBV RNA水平可以反映肝內HBV cccDNA的狀態及活性（P=0.001）。

為了使更多患者實現臨床治愈（血清HBsAg轉陰或血清學轉換）這一抗病毒治療的理想終點，有專家提出，可以通過對患者進行血清HBsAg和HBV RNA精準定量檢測，聯合使用血清HBsAg和HBV RNA對患者進行監測。將血清HBsAg＜1500 IU/ml的NUCs經治CHB患者按血清HBV RNA檢測結果分為HBV RNA陽性患者（HBV cccDNA轉錄及RNA病毒復制）和血清HBV RNA陰性患者（HBV cccDNA耗竭或轉錄靜默），對前者在繼續使用NUCs治療的前提下加用Peg-IFN；對后者則停用NUCs，改用Peg-IFN治療。這一基于血清HBV RNA檢測的以臨床治愈為目標的治療方案有可能進一步提高CHB患者臨床治愈率、降低社會成本[39]。

2.3.3 血清HBV RNA應用的局限性 血清HBV RNA的概念剛剛提出，因此，對于血清HBV RNA水平與肝組織HBV cccDNA水平的相關性仍須進一步確定。另外，檢測RNA時容易受到污染。因此，須要建立靈敏度高，精確度好的檢測方法。

3　小結與展望

目前CHB患者抗病毒治療藥物仍以NUCs為主，理想的治療終點和可能產生的耐藥性成為治療中不可回避的問題。因此，在治療中對患者的實時跟蹤就顯得尤為重要。傳統的HBeAg血清學轉換以及HBV DNA檢測已經不能滿足現在的需求，而且由于血清HBsAg不能完全代表肝細胞內HBV復制情況且血清HBsAg陰轉不易達到，因此，迫切需要更好的能指導CHB患者治療的新指標。雖然現在認為肝組織HBV cccDNA、血清HBcrAg和血清HBV RNA都是具有潛力的監控CHB患者安全停藥的指標，但是仍然需要前瞻性的隊列研究證實；同時，若要應用于臨床，還須要建立特異的、靈敏的、穩定的標準化檢測方法。如果在以后的研究中能夠找到更為合理的一項或一組監測CHB患者停藥的指標，則對于減輕患者和社會負擔具有重要意義。