前列腺癌患者血清miRNA-711水平變化及意義

張仁忠，朱雯銀，劉吉文，姜睿

(1西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州 646000；2邛崍市醫療中心醫院；3中國人民解放軍成都軍區總醫院)

前列腺癌(PCa)是發達國家男性中最常見的惡性腫瘤之一[1]，尋找用于評估PCa的發展過程且具有診斷特征的指標對于PCa有效治療至關重要。血清前列腺特異抗原(PSA)是PCa臨床篩選和診斷、預后判斷的重要指標，但PSA臨床診斷仍具有一定的局限性，如前列腺增生等疾病等均可引起PSA水平升高[2,3]。微小RNA(miRNA)是指約22個核苷酸長度的小的非編碼RNA，被認為是細胞基因表達的強大調節劑，幾乎參與所有的生命活動過程[4]。同時，miRNA表達失調與許多腫瘤的發生、進展有關，被認為是所有癌癥類型中較為有診斷價值和預測腫瘤預后的生物標志物[5,6]。miRNA-711是一種抑制腫瘤增殖的新型miRNA[7]，其與PCa的關系尚未見報道。本研究觀察了PCa患者血清中miRNA-711的水平變化，并探討其意義。現報告如下。

1　 資料與方法

1.1臨床資料選擇2015年1月～2017年5月就診于邛崍市醫療中心醫院泌尿外科、中國人民解放軍成都軍區總醫院泌尿外科的PCa患者40例(PCa組)，年齡(64.39±7.87)歲。所有患者未接受放化療治療。按照美國癌癥聯合會(AJCC)TNM分期標準，Ⅰ期14例、Ⅱ期5例、Ⅲ期11例、Ⅳ期10例；按照Gleason分級，8～10分24例、7分7例，2～6分9例。同時選擇前列腺增生(BPH)患者40例(BPH組)及健康體檢男性對照者40例(對照組)，兩組年齡分別為(61.85±5.39)、(57.72±6.20)歲。三組年齡比較具有可比性。本研究對象已簽署知情同意書并通過醫院倫理委員會批準。

1.2血清miRNA-711檢測方法采用無菌抗凝管收集各組靜脈血標本4 mL，提前預冷離心機4 ℃下3 000 r/min離心15 min，提取上清液2 mL，再次1 500 r/min離心3 min，提取上清無細胞液300 μL。用1 mL TRIzol試劑將血清混合,將以上混合液標本轉移到1.5 mL的EP管中，室溫下放置5 min。然后加入等體積的氯仿，加蓋后劇烈搖晃15 s，在室溫下放置5 min，4 ℃下12 000 g離心15 min。將上層水相RNA轉移到另一干凈的EP管中，加入0.5 mL異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃下12 000 g離心10 min。離心后看到絮狀膠樣RNA沉淀。RNA洗滌去上清，加入0.6 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，4 ℃下7 500 g離心5 min。RNA再溶解去上清，置空氣中5～10 min。用無RNase水重懸RNA沉淀，用槍頭反復吹打幾次，55～60 ℃靜置10 min。取2 μL儲存液加入另一個EP管中，再加入98 μL無RNase水，離心混勻，以無RNase水作為空白對照，測OD260/280值。OD260/280值在1.8～2.0可進行下一步實驗。血清miRNA-711檢測采用RT-qPCR技術。采用50 μL體積作為反應體系進行反轉錄反應實驗，試驗體系中包括5×的反應緩沖液10 μL，使用2 μg RNA模板、1 μL的RNA酶抑制劑、1 μL的反轉錄酶、4 μL的2.5 nmol/L dNTP Mix，加入去RNA酶水定容至50 μL。在美國羅氏公司PCR儀器上設置反轉錄反應程序：42 ℃條件下反應60 min，70 ℃條件下反應10 min。RT-qPCR反應體系包括：Bulge-LoopTMmiRNA RT-qPCR Primer Kit、dNTP mix、Taq酶、反轉錄產物、SYBR Green Ⅰ、去RNA酶水(均購自HaiGene生物試劑公司)，反應條件：95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 5 s，共40個循環。Has-miRNA-711引物序列為：5′-GGGACCCTGG-GAGAGATGTAAG-3′。每個樣本設3個復孔，以U6為內參，采用2-ΔCt法計算miRNA-711水平。

2　結果

2.1各組血清miRNA-711水平比較PCa組、BPH組、對照組血清miRNA-711水平分別為15.65±3.97、19.47±3.51、20.53±4.26，PCa組與BPH組、對照組相比P均<0.05。

2.2血清miRNA-711水平與PCa臨床病理特征的關系見表1。

表1　　　　血清miRNA-711水平與PCa臨床病理特征的關系

3　討論

臨床上，采用PSA診斷PCa會不斷地增加新的PCa病例的數量，然而關于篩查PSA是否有效降低PCa的死亡風險尚未達成共識[8]。由于PSA診斷PCa特異性較低，因此找出檢測PCa的特定分子標志物可能是加快PCa診斷、預后和治療的理性方法。miRNA是一組小的非編碼RNA，通過靶向相應的mRNA來轉錄后調節基因表達[9,10]。許多研究報道miRNA與腫瘤的發生、發展息息相關，因而與腫瘤相關的miRNA標志物成為了研究熱點[11]。目前研究表明，大部分miRNA與癌癥有密切的關系，其中有部分miRNA已被證明在PCa中發揮重要的作用，并且具有一定的評估預后的臨床價值[12～14]。

目前，關于miRNA-711的報道較少。miRNA-711在各種不同的病理組織狀況下可表現為不同的作用,如miRNA-711在乳腺癌和皮膚T細胞淋巴瘤中具有致癌性；在胃癌中是一種腫瘤抑制因子[15,16]；在HPV陽性宮頸癌細胞中被鑒定為一種新型miRNA診斷標志物[17]。除了癌癥外，miR-711在外傷性腦損傷、心肌梗死和胰島素抵抗中均具有重要的作用[16]。本研究發現，PCa組血清中miRNA-711水平低于BPH組、對照組，Ⅲ、Ⅳ期的PCa患者血清miRNA-711水平比Ⅰ、Ⅱ期者低，Gleason病理評分>7分的PCa患者血清miRNA-711水平比≤7分者低，提示miRNA-711可能參與了腫瘤細胞的發生、增殖、遠處轉移。通過本次研究，我們發現miRNA-711是PCa中一種新型的miRNA，可作為PCa分級、預后評估的監測因子和潛在治療靶點，同時通過檢測血清中的miRNA-711水平能有助于提高PCa早期的輔助診斷率。

綜上可見，PCa患者血清miRNA-711水平降低，miRNA-711可能作為抑癌因子參與了PCa的發生與發展過程，可能是PCa診斷、預后評估的新型生物標志物，但其對PCa具體的機制仍需進一步探索。