原因不明性復發性流產患者月經周期外周血調節性T細胞水平變化

王德勝，王曙光，馮麗燕，黃小霞，馬飛

(1東莞市第五人民醫院，廣東東莞 523981；2中山大學附屬第六醫院)

原因不明性復發性流產(URSA)是一種常見的妊娠并發癥，指連續發生2次或2次以上的自然流產，并排除染色體、解剖、內分泌、自身免疫功能異常及生殖道感染等病因的復發性流產，發病率為1%～2%[1]。正常妊娠類似于半同種異體移植，攜帶父源HLA抗原的胚胎不被母體免疫系統排斥，有賴于母胎之間建立的免疫耐受。研究證實，CD4+CD25+FoxP3+調節性T細胞(Treg)對母胎免疫耐受的維持和正常妊娠至關重要[2]。最近研究[3,4]顯示，Treg與URSA的發生密切相關，與正常孕婦相比，其在URSA患者外周血中的比例明顯降低。然而，關于URSA患者外周血Treg比例在月經周期的不同階段是否會發生規律性變化的報道相對較少。因此，本研究將針對URSA患者，在月經周期的月經期、增殖期和分泌期等不同階段分別抽取外周血，應用多色流式細胞術探討Treg變化規律，以期為URSA發病機制和淋巴細胞主動免疫治療提供新的理論基礎。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2015年10月～2016年12月在東莞市第五人民醫院婦產科門診就診并診斷為URSA的患者35例為研究對象(URSA組)，年齡21～40(30.74±4.41)歲，月經周期(30.77±2.13)d，流產次數(3.66±0.87)次。URSA診斷標準：①有2次或2次以上的自然流產；②排除生殖道感染與畸形；③夫妻雙方染色體分析均正常，無家族遺傳病史；④女方內分泌及激素檢查結果均正常；⑤無自身免疫性疾病；⑥男方精液常規正常；⑦封閉抗體陰性。選擇同期在我院工作、至少有1次正常妊娠生育、招募時無懷孕的健康女職工40例為對照組，年齡21～40(31.00±5.13)歲，月經周期(31.33±2.16)d，既往無自然流產、早產、死胎或宮外孕史。兩組年齡、月經周期比較差異無統計學意義，流產次數比較P<0.01。所有招募者采血時間距離末次流產或正常妊娠生育后至少3個月。本研究獲得受試者的知情同意和東莞市第五人民醫院倫理委員會的批準。

1.2外周血Treg檢測分別于月經周期的第2～4天(月經期)、11～13天(增殖期)和21～23天(分泌期)，采集受試者外周靜脈血1 mL，應用4色熒光染色和流式細胞術檢測。先進行表面染色(CD3FITC/CD4APC-Cy7/CD25PE-Cy7)，然后進行胞內染色(FoxP3 PerCP-Cy5.5)。染色后重懸于0.5 mL 2%的多聚甲醛中，于24 h內上機檢測，各細胞亞群的變化采用FlowJO7.6軟件分析。

2　結果

URSA組月經期采血時間為月經周期的第(2.71±0.75)天，增殖期采血時間為月經周期的第(13.11±1.11)天，分泌期采血時間為月經周期的第(23.14±1.19)天，對照組分別為第(2.78±0.73)、(13.28±1.28)、(23.35±1.33)天，兩組采血時間比較差異無統計學意義。兩組月經周期外周血Treg水平比較見表1。

表1　兩組月經周期外周血Treg水平比較

注：與同組月經期、分泌期相比，*P<0.01；與對照組增殖期相比，#P<0.01。

3　討論

正常妊娠時，胎兒作為“半同種移植物”，不被擁有正常免疫功能的母體排斥直至足月分娩，這是生殖生物學的一個典型特征[5]。1953年，Medawa第一次提出母體免疫系統與胎兒抗原之間的關系，自此人們從免疫的角度對母胎免疫耐受的認識逐漸加深[6～8]。研究[2,9]證實，Treg對母胎免疫耐受的維持和正常妊娠至關重要。Treg作為輔助性CD4+T細胞的一個亞群，在限制機體免疫系統對抗感染、炎癥和自身免疫反應的發生中起重要作用[5]。而且，臨床研究[10]也發現，正常妊娠期間Treg的比例明顯升高，而復發性流產(RSA)患者則無此現象。RSA指2次或2次以上的自然流產者，在計劃懷孕的婦女中發生率高達5%[5]。RSA的病因十分復雜，主要包括遺傳因素(包括胚胎自身發育過程中出現的異常以及遺傳自父母的異常)、解剖因素、內分泌因素、感染因素、免疫功能異常、血栓前狀態、孕婦的全身性疾病及環境因素等[11]。近年來，隨著生殖免疫學研究的不斷深入，發現約半數的RSA與免疫功能紊亂有關；根據不同因素導致免疫病理類型的差異，進一步分為自身免疫型RSA和同種免疫型RSA，由于后者仍處于研究階段，又常常被稱為URSA[11]。研究[12,13]顯示URSA患者外周血及蛻膜中Treg顯著降低。

本研究采用多色流式細胞術對URSA患者和健康女性月經周期不同階段外周血Treg比例進行檢測，發現兩組外周血Treg在月經周期出現了典型的動態變化，兩組增殖期的細胞比例均為最高。這提示，月經周期的增殖期是受孕及受精卵著床的關鍵時期，升高的Treg通過負調控機體的免疫功能，對母胎免疫耐受的建立可能起到關鍵性作用。進一步分析發現，在增殖期，URSA組Treg比例較對照組降低。之前有研究[14]發現，自發性流產的患者外周血Treg與正常妊娠女性相比無顯著性差異，我們推測這可能樣本的選擇的月經周期的不同時期有關。上述研究外周血采集在月經周期的哪個時期不詳，事實上，本研究中出現明顯差異的是月經周期中的增殖期，在月經期和分泌期也無差異。越來越多的研究[15,16]顯示，RSA患者外周血Treg的比例較正常妊娠女性明顯降低。最近Sereshki等[4]通過對比URSA患者和對照組月經周期的增殖期和分泌期發現，對照組增殖期Treg的比例較URSA組明顯升高，這與本研究結果相一致。最后，由于本研究僅對月經周期不同階段外周血Treg所占的比例進行了檢測，而其相關的功能性細胞因子如IL-10和表面抑制性受體如CD39、CTLA-4的表達并未進行研究。進一步研究URSA患者外周血Treg的功能及其表面標志在月經周期不同階段是否會出現規律性變化，對URSA發病機制及其免疫治療將會起到極大的促進作用。

綜上所述，外周血Treg水平在URSA患者月經周期中呈現典型的動態變化，且在增殖期URSA患者的比例低于健康女性，免疫功能的紊亂在URSA發病過程中可能具有重要作用。