人參四物湯預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及機制探討

張世亮,續自鳳,房美

(1山東中醫藥大學附屬醫院，濟南250011；2山東中醫藥大學中醫學院；3山東中醫藥大學第一臨床學院)

缺血再灌注(IR)后的心肌損傷可引起心肌抑頓、心律失常甚至猝死等事件，嚴重影響心肌梗死再灌注患者的預后。因此，如何有效減輕IR造成的心肌損傷有重要研究意義。目前認為，心肌IR損傷與能量代謝障礙、炎癥反應、氧化應激、自噬及心肌細胞凋亡等相關[1]。炎癥反應通過中性粒細胞浸潤和炎癥介質釋放，破壞血管內皮細胞，改變血管內皮通透性等，促進心肌IR損傷的發展。其中，白細胞介素6(IL-6)是介導炎癥反應的重要環節。臨床應用中發現，人參四物湯緩解心絞痛、心前區不適、心慌等癥狀起效迅速，明顯改善患者心電圖ST-T改變，提高患者的活動耐量[2]。2017年9～11月，我們觀察了人參四物湯預處理對大鼠心肌IR損傷的影響，并探討其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品、試劑和儀器人參四物湯，主要成分為人參、熟地、當歸、川芎、赤芍、煅牡蠣、龍眼肉、三七粉、丹參、麥冬等，由山東山東中醫藥大學制劑室提供。血清乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸激酶同工酶(CK-MB)、IL-6檢測試劑盒(Boster公司)；TUNEL試劑盒(Roche公司)；多導生理記錄儀BL-420E(成都泰盟科技有限公司)；HX-200動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；EG1150H全自動包埋機、RM2235型石蠟切片機(Leica公司)；LDZ5-2型離心機(北京離心機廠)；Image-Pro Plus 多功能圖像分析管理系統(Media Cybernetics)；BX-5光學顯微鏡(Olympus公司)。

1.1.2實驗動物健康雄性Wistar大鼠40只，體質量220～250 g，由山東大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(合)20170021。均以標準嚙齒類飼料飼養，自然光照，自由飲水、飲食。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組與用藥處理將大鼠隨機分為假手術(Sham)組、IR組及人參四物湯低劑量(A)組、高劑量(B)組，每組10只。適應性喂養1周后，進行實驗。A、B組給予人參四物湯20、80 mg/kg灌胃，Sham組、IR組予以等量生理鹽水灌胃，連續7 d。

1.2.2動物模型制備各組末次給藥后，用3.5%水合氯醛(1.0 mL/100 g)腹腔注射；麻醉成功后，將大鼠仰臥固定于手術臺上。氣管插管，呼吸機輔助通氣，接心電圖記錄儀，記錄標準肢體Ⅱ導聯。在胸骨左約5 mm處、第3～4肋間剪開皮膚，鈍性分離皮下組織、肌肉；暴露胸腔，剪開心包膜；擠壓胸腔，固定心臟；在左心耳與肺動脈圓錐之間，暴露冠狀動脈左前降支(LAD)。用5-0無損傷縫合線于左心耳根部下方1～2 mm處，以深1～2 mm、寬2～3 mm緩慢穿過心肌表層并結扎。Sham組大鼠只穿線不結扎。IR組和A、B組均結扎LAD 30 min，造成心肌缺血后剪斷無損傷縫合線，再灌注120 min以制備大鼠IR模型。結扎成功標準：心電圖示標準肢體Ⅱ導聯ST段明顯抬高或T波高聳，心肌顏色變淺紅色；IR模型成功標準：剪斷無損傷縫合線后記錄的標準肢體Ⅱ導聯ST段降低≥50%，心肌顏色逐漸轉為紅潤。再灌注120 min后取材，測定各項指標。

1.2.3血清LDH、CK-MB檢測經下腔靜脈緩慢取血10 mL，肝素抗凝；靜置15～20 min后3 000 r/min離心10 min,收集血清。采用ELISA法檢測血清LDH、CK-MB，按照試劑盒說明書操作。

1.2.4心肌組織病理形態學觀察經頸靜脈注射2 mL伊文思藍，梗死區心肌呈現藍色，非梗死區未染色。取血結束后(麻醉狀態)，立即摘取心臟，用生理鹽水沖洗干凈；沿冠狀溝切除右心室，留取左心室。垂直于心臟長軸將心室切成5片，以10%甲醛溶液固定，進行心肌石蠟標本制備；其余心肌組織用于IL-6水平檢測。每例標本取1片心肌組織，常規石蠟包埋，并切4 μm薄片；HE染色，光學顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理學改變。

1.2.5心肌梗死面積測算將大鼠心肌水平切成1～2 mm的薄片，TTC染色。正常心肌可染成紅色，梗死區未染色。應用多功能圖像分析系統計算左心室面積及梗死區面積。梗死面積=梗死區面積/左心室總面積×100%。

1.2.6心肌組織細胞凋亡檢測采用TUNEL法。以脫氧核苷酸轉移酶(TDT)介導的TUNEL標記凋亡細胞核DNA-OH末端，按試劑盒說明書操作。凋亡細胞為細胞核中有棕黃色或棕褐色顆粒，正常細胞呈藍色。采用Olympus BX-5光學顯微鏡觀察，隨機選取5個視野進行拍攝，分別計數每個視野內凋亡陽性細胞數和總細胞數，計算凋亡指數(AI)。AI=視野內凋亡細胞個數/視野內心肌細胞總數×100%。

1.2.7心肌組織勻漿液中IL-6檢測剪取左心室心底部部分心肌組織(mg計量)，以100∶ 1混入生理鹽水(mL計量)；置于含1 μg/L蛋白酶抑制劑的PBS中勻漿，離心后取上清液于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測IL-6，按照試劑盒說明書操作。

2　結果

2.1各組大鼠血清LDH、CK-MB水平比較與Sham組比較，IR組大鼠血清LDH及CK-MB水平升高(P均<0.01)；與IR組比較，A組、B組血清LDH及CK-MB水平均下降(P均<0.05)，且B組較A組血清LDH及CK-MB水平降低(P均<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血清LDH、CK-MB水平比較

注：與Sham組比較,aP<0.05，bP<0.01；與IR組比較，cP<0.05；與A組比較，dP<0.05。

2.2各組大鼠心肌組織病理形態學比較Sham組大鼠心肌組織僅穿線周圍見少量纖維結締組織及散在的慢性炎性細胞浸潤，考慮為穿線所致，其余部位心肌組織未見明顯病理學改變。IR組大鼠心肌組織間質水腫變性明顯，肌纖維紊亂，心肌細胞胞質著色不均勻，可見空泡變性。與IR組比較，A組、B組結扎周圍心肌細胞的病變程度明顯減輕。

2.3各組大鼠心肌梗死面積及心肌細胞凋亡情況比較見表2。

表2　　　　各組大鼠心肌梗死面積及心肌細胞凋亡情況比較

注：與Sham組比較,aP<0.05，bP<0.01；與IR組比較，cP<0.05；與A組比較，dP<0.05。

2.4各組大鼠心肌組織勻漿液IL-6水平比較Sham組、IR組、A組、B組大鼠心肌組織勻漿液IL-6分別為(14.07±3.42)、(36.41±3.44)、(26.72±3.33)、(21.70±2.96)ng/mL， IR組>A組>B組>Sham組(P均<0.05)。

3　討論

目前，急性心肌梗死仍是我國發病率和病死率較高的疾病之一。隨著冠脈介入及搭橋、冠狀動脈內溶栓等再灌注治療的廣泛應用，IR損傷成為影響介入療效的重要因素。

炎癥反應是IR的重要機制之一，中性粒細胞起重要作用。由于炎癥反應在心肌缺血階段即被激活，經過再灌注，缺血區血液充盈后，炎癥細胞進入缺血區，加重IR損傷[3]。同時，IR激活中性粒細胞釋放IL-6、IL-1、腫瘤壞死因子α等炎癥介質，使中性粒細胞與冠狀動脈微血管內皮細胞黏附因子結合，引起血管內皮損傷，內皮功能與結構被破壞，進一步誘導心肌損傷，進而加重心肌缺血。IL-6是炎癥反應的重要介質[4]，正常心肌不表達或低表達IL-6，心肌IR可誘導心肌細胞產生IL-6[5]。IL-6處于炎癥反應調控的樞紐，可誘導中性粒細胞內流入缺血心肌組織，刺激中性粒細胞、心肌細胞表面分別表達CDⅡb及細胞間黏附分子1，損傷心肌，導致心肌細胞凋亡。IL-6參與IR過程，其升高在一定程度上反映心肌梗死再灌注的損傷[6]。抑制IR大鼠炎癥因子釋放，對心肌細胞具有保護作用。本實驗結果發現，IR組心肌組織梗死面積、心肌細胞凋亡明顯增加，同時伴有心肌組織IL-6水平升高，說明該處組織心肌損傷在持續發展。人參四物湯灌胃預處理大鼠心肌梗死面積、心肌細胞凋亡和心肌組織中IL-6水平較IR組明顯降低，說明人參四物湯對IR大鼠心肌損傷有一定抑制作用。

中醫認為，冠心病屬于“胸痹”“真心痛”的范疇，基本病機為心脈痹阻，“氣虛血瘀”是發病的主要機制之一。“胸痹”屬本虛標實之病，本虛則心氣不足、心陽不振、心神失養，標實則氣滯血瘀或痰飲阻滯,故治療應當標本兼顧,以治本為要。人參四物湯以人參、三七、丹參、川芎、熟地、當歸、麥冬、龍眼肉、煅牡蠣等組成，具有益氣養陰，活血化瘀之效。方中人參大補元氣、益氣養心，三七活血化瘀，共為君藥；丹參活血通脈，當歸補血活血，助君藥益氣活血化瘀；麥冬養陰生津，熟地滋陰養血，川芎活血行氣，使諸藥補而不滯,共為臣藥；龍眼肉補益心脾,養血安神，煅牡蠣鎮心安神共為佐使。諸藥合用共作益氣養陰、活血化瘀之效。現代藥理研究表明，皂苷類化合物是人參、三七中主要的活性成分。人參總皂苷、三七皂苷在心血管疾病的防治方面有明確的藥理效應[7]，臨床應用廣泛。其在抗心肌缺血，保護心肌細胞方面的作用機制與減少細胞內鈣離子超載、保護線粒體功能、抑制炎癥反應及抑制凋亡相關基因的過度表達等有關[8～10]。人參皂苷CK通過干預炎癥細胞因子高遷移率族蛋白B1的表達，抑制炎癥的上游細胞活化，降低血清IL-6水平等，發揮對心肌缺血再灌注損傷的保護作用[11]。人參皂苷Rb1通過促進缺血心肌血管內皮細胞再生[12]，參與心肌IR損傷的保護。三七總皂苷可以通過升高細胞內cAMP，抑制炎癥細胞釋放氧自由基起到抗炎的作用[13]。丹參通過抑制IR大鼠血清IL-6釋放[14]，抑制Nox-2/ROS/JNK2/NF-κB通路，降低凋亡相關蛋白的表達，減少心肌細胞凋亡。另外，丹參酚酸A明顯抑制心肌缺血時的炎癥反應[15]。

綜上所述，人參四物湯預處理能縮小心肌IR后心肌梗死面積，減少心肌細胞凋亡的發生，對心肌IR損傷有明顯抑制作用，其機制可能與抑制IL-6釋放有關。