苦參堿對乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制

肖旭，敖曼，石文達(dá)，王佳旭，樸宗方，李代曉，胡久麗，王瑩，李青山，徐繁

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000)

乳腺癌是女性群體中最常見的癌癥類型之一，有年輕化趨勢，對女性健康造成嚴(yán)重威脅。我國乳腺癌的發(fā)病率有明顯上升趨勢[1]。目前對于乳腺癌的治療方法仍然主要以手術(shù)治療、放化療為主，這些治療方式都對患者的身心造成損害。近年來，某些具有抗癌作用的中藥提取物因抗腫瘤作用確切，且不良反應(yīng)小而受到腫瘤研究的廣泛關(guān)注，但至今中藥提取物的抗腫瘤作用機(jī)制尚不明確。苦參堿(MAT)是苦參、苦豆子、廣豆根等豆科槐屬植物中生物堿的主要成分，體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)其能夠抑制多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[2～4]。研究[5,6]發(fā)現(xiàn)，某些miRNA參與了MAT的抗腫瘤作用過程。miR-21位于染色體17q23,被公認(rèn)為惡性腫瘤的原癌基因[7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21/PTEN信號通路在包括乳腺癌在內(nèi)的眾多惡性腫瘤的增殖、凋亡中發(fā)揮著重要的作用[8,9]，許多中藥抗腫瘤提取物通過干預(yù)miR-21/PTEN通路起著抗腫瘤的作用[10,11],但目前有關(guān)MAT能否通過干預(yù)乳腺癌miR-21/PTEN通路發(fā)揮抗腫瘤作用尚不明確。本研究觀察了不同濃度的MAT對乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞增殖、凋亡的影響，探討MAT在乳腺癌中的可能作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑MAT(純度≥98%)購自寧波天衡制藥公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol均購自美國Invitrogen公司；miR-21 mimics及陰性對照mimics-NC、miR-21及內(nèi)參U6引物由廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成；反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、SYBR?Green qPCR試劑盒購自大連寶生物工程公司；PTEN單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞來源及培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3購自美國ATCC，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.3MAT對乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞增殖、凋亡及miR-21、PTEN蛋白影響的觀察

1.3.1細(xì)胞增殖抑制率測算采用CCK-8法。取對數(shù)生長期SK-BR-3細(xì)胞消化后制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L。分別取200 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h；棄培養(yǎng)基，PBS清洗2遍。分別加入終濃度為0、0.5、1、2、3 mg/L MAT的含藥物培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，再將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，向每孔中加入10 μL CCK-8反應(yīng)液，同樣條件下繼續(xù)孵育3 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm 處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.3.2細(xì)胞凋亡率測算采用流式細(xì)胞術(shù)。取對數(shù)生長期的SK-BR-3細(xì)胞，消化接種于24孔板；培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，PBS清洗2遍。分別加入終濃度為0、0.5、1、2、3 mg/L MAT的含藥物培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，PBS 洗滌2遍。以不含EDTA的胰蛋白酶消化,并制備單細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液5 mL置于流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后再加入5 μL PI，混勻后室溫避光反應(yīng)10 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3.3細(xì)胞miR-21檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR。取對數(shù)生長期的SK-BR-3細(xì)胞,給予不同濃度MAT干預(yù)培養(yǎng)，具體方法同1.3.2，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。使用TRIzol試劑提取SK-BR-3細(xì)胞總RNA，核酸蛋白測定儀對總RNA濃度進(jìn)行質(zhì)控，1.8

1.3.4細(xì)胞PTEN蛋白檢測采用Western blotting法。取對數(shù)生長期的SK-BR-3細(xì)胞,給予不同濃度MAT干預(yù)培養(yǎng)，具體方法同1.3.2，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞3遍，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃離心15 min后收集上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。每泳道上樣50 μg蛋白，80 V/120 V進(jìn)行10% SDS-PAGE分離;將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h后加入兔抗小鼠PTEN單克隆抗體(1∶ 1 000)以及兔抗小鼠β-actin抗體(1∶ 3 000)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶ 1 000);TBST洗膜3次，每次5 min，加入ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑顯影、定影。以β-actin條帶為對照計(jì)算PTEN蛋白的相對表達(dá)量。

1.4miR-21轉(zhuǎn)染對乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞miR-21、PTEN蛋白表達(dá)及凋亡影響的觀察

1.4.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及處理取對數(shù)生長期的SK-BR-3細(xì)胞，將細(xì)胞分為mimics-NC+空白培養(yǎng)液組、miR-21 mimics+空白培養(yǎng)液組、mimics-NC+MAT組、miR-21 mimics+MAT組。各組消化接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)50%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。mimics-NC+空白培養(yǎng)液組、mimics-NC+MAT組轉(zhuǎn)染mimics-NC，miR-21 mimics+空白培養(yǎng)液組、miR-21 mimics+MAT組轉(zhuǎn)染miR-21 mimics。采用LipofectamineTM2000將miR-21 mimics和mimics-NC轉(zhuǎn)染至SK-BR-3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h棄培養(yǎng)基，PBS清洗2遍。mimics-NC+空白培養(yǎng)液組、miR-21 mimics+空白培養(yǎng)液組采用空白培養(yǎng)液培養(yǎng)，mimics-NC+MAT組、miR-21 mimics+MAT組加入終濃度為2 mg/L MAT的含藥物培養(yǎng)基。各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2細(xì)胞miR-21表達(dá)檢測取1.4.1各組細(xì)胞，檢測方法同1.3.3。

1.4.3細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)檢測取1.4.1各組細(xì)胞，檢測方法同1.3.4。

1.4.4細(xì)胞凋亡率測算取1.4.1各組細(xì)胞，檢測方法同1.3.2。

2　結(jié)果

2.1不同濃度MAT干預(yù)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞增殖抑制率比較0、0.5、1、2、3 mg/L MAT干預(yù)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞的增殖抑制率分別為0、24.9%±2.8%、33.8%±3.2%、48.9%±5.3%、59.9%±3.1%，兩兩相比P均<0.05。

2.2不同濃度MAT干預(yù)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞凋亡率比較0、0.5、1、2、3 mg/L MAT干預(yù)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞的凋亡率分別為5.3%±0.3%、19.0%±2.3%、27.2%±2.2%、38.2%±3.0%、46.6%±3.2%，兩兩相比P均<0.05。

2.3不同濃度MAT干預(yù)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞miR-21表達(dá)比較0、0.5、1、2、3 mg/L MAT干預(yù)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞miR-21的相對表達(dá)量分別為1.02±0.05、0.75±0.08、0.57±0.06、0.43±0.04、0.28±0.07，兩兩相比P均<0.05。

2.4不同濃度MAT干預(yù)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)比較0、0.5、1、2、3 mg/L MAT干預(yù)乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)分別為0.14±0.05、0.30±0.06、0.79±0.14、1.11±0.10、1.89±0.22，兩兩相比P均<0.05。

2.5轉(zhuǎn)染miR-21后各組細(xì)胞miR-21、PTEN蛋白表達(dá)及凋亡率比較見表1。

表1　　　　轉(zhuǎn)染miR-21后各組細(xì)胞miR-21、PTEN蛋白表達(dá)及凋亡率比較

注：與mimics-NC+空白培養(yǎng)液組比較，*P<0.05；與mimics-NC+MAT組比較，#P<0.05；與miR-21 mimics+空白培養(yǎng)液組比較，△P<0.05。

3　討論

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞自主死亡的過程。乳腺細(xì)胞的異常增生與凋亡通常是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生的主要原因。誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡是目前治療乳腺癌藥物重要的作用機(jī)制之一[12]。MAT是中國傳統(tǒng)中藥苦參的主要生物堿之一，其分子式為C12H24N20，屬于四環(huán)的喹嗪啶類，分子骨架可看作2個(gè)喹嗪啶的雜體。MAT除具有抗炎、抗病毒、保肝、保護(hù)心血管系統(tǒng)、鎮(zhèn)痛等作用外，還對體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對機(jī)體正常細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生破壞作用[13]。因此，MAT受到學(xué)者的廣泛關(guān)注，具有很大的應(yīng)用前景。

本研究采用不同終濃度的MAT對乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，通過CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測了MAT對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAT對乳腺細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，能夠促進(jìn)其凋亡，并且具有明顯的濃度依賴性，這與相關(guān)研究[14]結(jié)果一致。但是，目前關(guān)于MAT對乳腺癌細(xì)胞抑制作用的具體機(jī)制尚不明確。miR-21作為乳腺癌的原癌基因之一，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。PTEN是目前公認(rèn)的抑癌基因之一，在包括乳腺癌的眾多惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中均起著抑癌基因的作用。miR-21/PTEN信號通路是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要信號通路，miR-21靶向調(diào)控PTEN基因參與乳腺癌的進(jìn)程[15]。近期Liu等[11]發(fā)現(xiàn)，中藥提取物新藤黃酸在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中通過miR-21/PTEN信號通路發(fā)揮抑瘤作用。Wang等[10]發(fā)現(xiàn)，中藥提取物姜黃素能夠通過miR-21/PTEN信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。本研究結(jié)果表明，MAT能夠明顯下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，并且隨著MAT濃度的逐漸升高，miR-21的表達(dá)逐漸降低，具有一定的濃度依賴性；另一方面，PTEN蛋白的表達(dá)隨著MAT濃度的逐漸升高而逐漸升高，也具有一定的濃度依賴性，認(rèn)為MAT可能通過miR-21/PTEN信號通路在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑瘤作用。

為了明確MAT是否能夠通過miR-21/PTEN信號通路在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑瘤作用，本研究應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-21 mimics進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞，成功上調(diào)miR-21的表達(dá)水平，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞PTEN蛋白水平隨之降低，并且凋亡率也明顯降低。這提示在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)miR-21的表達(dá)能夠下調(diào)PTEN蛋白的表達(dá)，并抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡。將轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細(xì)胞應(yīng)用2 mg/L MAT培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MAT能夠明顯降低轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，上調(diào)PTEN蛋白的表達(dá)，并且上調(diào)細(xì)胞的凋亡率，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞的作用。上述結(jié)果充分表明，MAT能夠通過抑制miR-21的表達(dá)，上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮抑瘤作用，miR-21/PTEN信號通路是MAT在乳腺癌中的作用通路之一。

綜上所述，MAT干預(yù)能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并呈濃度依賴性；MAT能夠通過抑制miR-21表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)，調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮抑瘤作用。