SIRT1激動劑對大鼠急性心肌梗死后心臟功能、心肌細胞凋亡的影響及機制

孫彬，曹清濤，劉金偉，李雅妮

(1濰坊醫學院附屬益都中心醫院,山東濰坊262500；2濰坊市人民醫院)

急性心肌梗死(AMI)已成為我國居民首位死因[1]，藥物、介入、冠狀動脈旁路移植術等治療技術不斷進展，在挽救患者生命及降低病死率方面發揮重要作用[2]。但是，缺血再灌注損傷及心室重構的存在，嚴重影響了療效及預后[3]。研究[4]表明，繼發性心肌細胞凋亡是缺血再灌注損傷發生及進展的重要病理機制。沉默信息調節因子1(SIRT1)作為輔酶Ⅰ依賴性的去乙酰化酶，在能量平衡、DNA修復、細胞增殖、分化及凋亡、炎癥等生理病理過程中發揮重要作用[5]。有研究[6]指出，SIRT1可減輕肝移植術后缺血再灌注肝實質細胞損傷；亦有研究[7]指出，耐力運動訓練可通過激活SIRT1信號通路而保護大鼠心肌。2017年9～12月，我們觀察了SIRT1激動劑SRT1720對AMI大鼠心臟功能及心肌細胞凋亡的影響，以及可能的機制，以期為該病臨床診療提供新的線索。

1　材料與方法

1.1實驗動物與主要試劑、設備40只健康雄性SD大鼠購自山東大學實驗動物中心[合格證號：SCXK(魯)20130009)]，8周齡，體質量250～280 g，飼養于標準環境下，自由進食和飲水，適應性飼養7 d后用于實驗。SRT1720購自美國Selleck公司，二甲基亞砜(DMSO)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)購自美國Sigma公司；HE染色試劑盒購自福州邁新生物技術公司，Masson染色試劑購自北京華越洋生物科技公司，TUNEL細胞凋亡試劑盒購自碧云天生物技術公司，2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)購自上海化學試劑總廠試劑三廠；兔抗大鼠SIRT1多克隆抗體、乙酰賴氨酸單克隆抗體、兔抗大鼠Bcl-2相關X蛋白(Bax)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗大鼠叉頭轉錄因子1(FoxO1)單克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體購自上海滬峰化工有限公司；超聲顯像儀購自荷蘭PHILIPS公司，凝膠電泳成像分析系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組與AMI模型建立采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組、溶媒組和激動劑組，每組10只。后三組按照曹旭丹等[8]的方法結扎左冠狀動脈前降支，以心臟局部缺血、發紺且心電圖ST段抬高為構建AMI模型成功。假手術組僅充分暴露心臟，將縫合絲線穿過而不結扎。激動劑組、溶媒組分別腹腔注射SIRT1激動劑SRT1720 20 mg/(kg·d)及等量的DMSO，假手術組、模型組均腹腔注射等量生理鹽水，連續7 d。實驗過程中模型組死亡1只，補充后保持樣本量不變；其余各組均無死亡。

1.2.2大鼠心臟功能檢查各組于末次給藥后次日，用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠；用超聲顯像儀行超聲心動圖檢查，分別檢測左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室射血分數(LVEF)和短軸縮短率(FS)。各指標均檢測3次，取平均值。

1.2.3大鼠梗死組織形態學檢查于心臟功能檢查后，處死各組大鼠；留取梗死區心肌組織，用4%甲醛固定。切片，常規脫水、石蠟包埋、切片，厚度約4 μm；按照HE染色試劑盒說明完成操作，觀察大鼠梗死區組織形態；利用Masson染色試劑染色后觀察梗死區纖維化情況，纖維化組織被染成藍色。

1.2.4大鼠梗死組織中細胞凋亡情況觀察取梗死區心肌組織，常規脫水、浸蠟、包埋、切片，厚度約0.4 μm。按照TUNEL細胞凋亡試劑盒說明進行染色，DAB顯色，高倍鏡下觀察。以細胞核中出現棕褐色顆粒狀物為陽性，隨機取5個視野計數陽性細胞數，計算凋亡指數。凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.5大鼠梗死組織中SIRT1、FoxO1、Bax和Bcl-2蛋白檢測取梗死區心肌組織，研磨勻漿后，加入細胞裂解液；用總蛋白提取試劑盒對總蛋白進行提取，采用BCA法檢測總蛋白濃度。取50 μg總蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉120 min。加入一抗兔抗大鼠SIRT1多克隆抗體、兔抗大鼠FoxO1單克隆抗體、兔抗大鼠Bax多克隆抗體和兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體(稀釋比例分別為1∶ 500、1∶ 1 200、1∶ 800和1∶ 1 000)，4 ℃過夜孵育，TBST沖洗3次；加入二抗，室溫孵育60 min，TBST沖洗3次；加入化學發光液避光反應15 min，顯影，拍照。用Image J圖像分析軟件對條帶進行分析，以GAPDH為內參獲得SIRT1、FoxO1、Bax和Bcl-2蛋白相對表達量。

1.2.6大鼠梗死組織中FoxO1乙酰化水平檢測參照1.2.5的方法提取總蛋白，并測定總蛋白濃度。按照每1 mg總蛋白加入3 μg的乙酰賴氨酸單克隆抗體，4 ℃過夜孵育。按照1.2.5的方法分別檢測FoxO1和酰賴氨酸表達水平，以FoxO1與酰賴氨酸電泳灰度值比值反映FoxO1乙酰化水平。

2　結果

2.1各組大鼠心臟功能比較見表1。

表1　各組大鼠心臟功能比較

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與溶媒組比較，cP<0.05。

2.2各組大鼠梗死組織形態學變化Masson和HE染色結果顯示，與假手術組比較，模型組和溶媒組大鼠心肌細胞出現大量變性壞死，胞核固縮，可見炎癥細胞浸潤，細胞間膠原纖維顯著增加；與模型組和溶媒組比較，激動劑組大鼠心肌細胞變性壞死及炎癥細胞浸潤減少，細胞間膠原纖維減少。

2.3各組大鼠梗死區組織中細胞凋亡情況假手術組、模型組、溶媒組和激動劑組大鼠心肌細胞凋亡指數分別為9.53%±1.17%、42.38%±3.44%、39.93%±2.75%、21.26%±3.01%，差異有統計學意義(F=328.700，P=0.000)；兩兩比較，模型組、溶媒組>激動劑組>假手術組(P均<0.05)；模型組、溶媒組大鼠心肌細胞凋亡指數無差異(P=0.053)。

2.4各組大鼠梗死組織中SIRT1、FoxO1、Bax、Bcl-2蛋白表達和FoxO1乙酰化水平比較見表2。

3　討論

AMI是臨床常見危重癥，近年來發病率不斷升高且呈年輕化趨勢[9]，給患者生命健康及家庭和社會帶來嚴重影響。研究[10]表明，心肌細胞凋亡和膠原纖維增生是導致心肌梗死后心力衰竭甚至死亡的主要病理過程。目前，現有的治療手段(藥物或介入治療)雖在一定程度上可改善患者預后，但并不能促進心肌細胞再生，甚至可能會加速心肌細胞凋亡及心室重構[11]。因此，如何有效阻止心肌細胞凋亡對改善AMI患者預后具有重要意義。

表2　各組大鼠梗死組織中SIRT1、FoxO1、Bax、Bcl-2蛋白表達和FoxO1乙酰化水平比較

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與溶媒組比較，cP<0.05。

SIRT1作為一種去乙酰化酶，可通過調控組蛋白/非組蛋白去乙酰化而在細胞凋亡、線粒體功能、能量代謝、氧化應激反應、炎癥反應等多種生理病理過程中發揮重要作用[12]。有研究[13]指出，激活SIRT1信號通路可減輕脂多糖誘導的大鼠心肌細胞炎癥反應。亦有研究[14]指出，SIRT1參與了糖尿病心肌損傷過程。SRT1720是新近研制的一種SIRT1激動劑，可特異性提高SIRT1蛋白表達及活性[15]。本研究利用腹腔注射SRT1720的方法對AMI大鼠進行干預，發現激動劑組大鼠梗死組織中SIRT1蛋白表達升高，提示SRT1720可促進大鼠梗死區組織中SIRT1蛋白表達。

本研究結果顯示，相比于假手術組，模型組和溶媒組大鼠LVEDD和LVESD均升高，LVEF和FS均降低；大鼠心肌細胞出現大量變性壞死，胞核固縮，可見炎癥細胞浸潤，細胞間膠原纖維顯著增加；TUNEL法檢測結果亦顯示，M組和V組大鼠心肌細胞凋亡指數顯著升高。這說明AMI大鼠心功能降低，出現心肌細胞凋亡及間質纖維化。然而，激動劑組大鼠心臟功能、心肌細胞凋亡及纖維化程度、心肌細胞凋亡指數均較模型組和溶媒組改善或減少。這說明激活SIRT1可有效改善心肌梗死大鼠心臟功能，減輕心肌細胞凋亡及心肌纖維化。

自噬是正常生理情況下細胞代謝及自我更新過程，但在氧化應激、炎癥等某些病理條件下可由于自噬過度激活而加速細胞凋亡，FoxO是調控自噬的關鍵性因子[16]。有研究[17]指出，SIRT1可通過調控FoxO乙酰化水平而在細胞增殖、凋亡、代謝中發揮重要作用。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，而Bax則是促凋亡基因，二者在調控細胞凋亡中發揮重要作用[18]。本研究結果顯示，與模型組和溶媒組比較，激動劑組大鼠梗死組織中SIRT1、FoxO1和Bcl-2蛋白相對表達量均升高，而Bax蛋白相對表達量和FoxO1乙酰化水平均降低。這說明SRT1720激活SIRT1蛋白表達可能通過抑制FoxO1乙酰化水平，促進Bcl-2表達，抑制Bax表達，從而抑制心肌細胞凋亡。

綜上所述，SIRT1激動劑可改善AMI大鼠心臟功能，減少心肌細胞凋亡；其機制可能與促進SIRT1表達及活性，下調FoxO1乙酰化水平有關。