中國北方高發區人群ABCB1基因多態性與食管鱗狀細胞癌發病風險的關系

孫立坤，徐昌青

(1山東大學第二醫院，濟南250033；2 山東省千佛山醫院)

目前，食管癌大體分為食管鱗狀細胞癌(簡稱鱗癌)和食管腺癌2種類型。從伊朗北部到中亞再到中國北方發病率均較高，被稱作“食管癌帶”，90%都是食管鱗癌。食管鱗癌發病與吸煙、飲酒、肥胖和飲食習慣有關，但是這些因素可能是小部分原因，基因突變可能是導致食管癌的最主要原因。ABCB1基因也叫多耐藥基因(MDR1)，位于染色體7q21，由28個外顯子組成。在不同的人群中ABCB1基因有超過50種單核苷酸多態性和3種插入或缺失突變[1]。在這些突變中，位于26外顯子的C3435T(rs1045642)是研究最多的與P-糖蛋白(P-gp)表達相關的突變之一。許多研究[2～5]表明，ABCB1 rs1045642基因多態會增加許多疾病如胃癌、急性白血病、乳腺癌、結腸癌、腎癌、帕金森病等的發病風險。本研究觀察了中國北方高發區(安陽)人群ABCB1 rs1045642、rs3789243、rs4148737基因多態性與食管鱗癌發病風險的關系。現將結果報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇安陽腫瘤醫院2004年2月～2005年7月未接受化療、放療的食管鱗癌患者，生存時間≥3個月，共175例(觀察組)。其中男101例、女74例，年齡(60.10±8.06)歲。手術或胃鏡取得所有患者食管癌組織，并經病理學檢查確診。同時隨機篩選安陽地區175例健康志愿者作為對照組，其中男101例、女74例，年齡(60.11±8.04)歲。觀察組和對照組根據年齡和性別1∶ 1配對。觀察組吸煙78例、飲酒48例、有食管癌家族史58例，對照組分別為73、37、36例，兩組吸煙例數相比差異無統計學意義，兩組飲酒、有食管癌家族史例數相比P均<0.05。

1.2ABCB1基因多態性觀察采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術檢測ABCB1基因多態性。采集兩組研究對象外周血5 mL，采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，-20 ℃保存備用。以外周血基因組DNA為模板進行PCR擴增，根據ABCB1基因序列采用Primer 5.0設計引物并用Oligo 5.0軟件檢測。反應體系:引物(10 μmol/L)0.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)0.5 μL、1 U Taq DNA聚合酶、2.5 μL 10×緩沖液(包括2 mmol/L Mg2+)、1.5 μL基因組DNA，然后加蒸餾水至25 μL。①ABCB1 rs1045642多態位點。引物F為5′-GCCCATCCTGTTTGACTG-3′，R為5′-TTGAAGAGAGACTTACATTAGGCA-3′。PCR擴增條件：變性94 ℃ 7 min,退火94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,共35個循環；最終延伸72 ℃ 7 min。擴增后5 μL的產物加1 U Mbol限制性內切酶37 ℃ 12 h，酶切片段用3%瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外線下觀察每個個體的基因型。若rs1045642位點是胞嘧啶，Mbol內切酶會把DNA鏈切成2個片段，72 bp和77 bp，如果是胸腺嘧啶，內切酶則不會把149 bp切開。②ABCB1 rs3789243多態位點。引物F為5′-TGGCATTTGATTGCTTCTACTTCA-3′，R為5′-TCACCCAGACAATAAGCCCAAG-3′。PCR擴增條件與rs1045642相同。擴增后取5 μL的產物，加1 U BsaHⅠ限制性內切酶37 ℃ 12 h。若rs3789243位點是胞嘧啶，2個片段分別為115 bp和73 bp，如果是胸腺嘧啶，內切酶則不會把188 bp切開。③ABCB1 rs4148737多態位點。引物F為5′-GCCTGGGCTGAGTGAATGAC-3′，R為5′-TTTCTGTTCGGATTCCCTCTTG-3′。PCR擴增條件除了退火溫度是62 ℃，其余與rs1045642相同。內切酶是BanⅠ，若是鳥嘌呤，內切酶會把DNA鏈切成2個片段，154 bp和65 bp，如果是腺嘌呤，內切酶則不會把219 bp切開。

1.3統計學方法采用SPSS16.0統計軟件。采用χ2檢驗分析3個多態位點的基因型分布Hardy-Weinberg平衡；采用條件logistic回歸比較兩組吸煙、飲酒、有食管癌家族史和基因型分布情況；采用獨立樣本t檢驗分析年齡分布；采用Phase V2.1構建3個基因多態的8個單倍型；采用條件logistic回歸模型分析ABCB1基因型和單倍型與食管鱗癌發病風險的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

兩組每個多態位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡方程(P均>0.05)。

2.1兩組ABCB1基因型分布比較見表1。

表1　兩組ABCB1基因型分布比較(例)

注：a采用條件單變量logistic回歸分析。

2.2ABCB1基因型與食管癌發病風險的關系將飲酒、食管癌家族史和rs1045642多態加入到條件多變量logistic回歸分析，通過逐步回歸法(Forward:LR)選擇絕對危險因素。發現飲酒和食管癌家族史均是食管癌的危險因素，然而rs1045642多態與食管癌沒有明顯相關性。見表2。

2.3ABCB1基因單倍型與食管癌發病風險的關系觀察組攜帶rs1045642 C-rs3789243 T-rs4148737

表2　　　　ABCB1中rs1045642基因型、飲酒、食管癌家族史與食管癌發病風險的關系(例)

注：a采用條件多變量logistic回歸分析。

A單倍型例數少于對照組(P=0.018,OR=1.774,95%CI:1.104～2.850)，剩下的7個單倍型與食管癌發病風險沒有明顯相關性。見表3。

表3　ABCB1基因單倍型與食管癌發病風險的關系(例)

注：a采用條件單變量logistic回歸分析；-/-表示任何一種其他單倍體；-/CCA表示CCA與其他任何單倍體之一的組合；其他同此。

3　討論

已有報道表明，許多基因的單核苷酸多態性可能導致或預防癌癥的發生，在這些基因中，ABCB1/MDR1基因在腫瘤的進展中起重要作用。本研究對中國人食管癌發病風險和rs1045642、rs3789243、rs4148737多態位點進行關聯性分析。食管癌的發生是個復雜的過程，是環境和基因相互作用的結果，最常見的環境因素是吸煙和飲酒。本研究觀察組飲酒者高于對照組，飲酒者似乎更易患食管癌，但吸煙與食管癌的發生沒有明顯相關性，食管癌家族史也對食管癌發生有影響。

ABCB1基因屬于ATP結合盒轉運蛋白超家族，編碼位于胞膜上的P-gp，它是具有廣泛底物特異性的ATP依賴的藥物外流泵。人類P-gp是一種磷酸化和糖基化的跨膜蛋白，由1 280個氨基酸組成，包括2個同源對稱序列，每個又包括6個跨膜區和1個ATP結合基序；它把底物從胞內轉移到胞外，并可能與捕獲的藥物分子在細胞膜的磷脂雙分子層相互作用。ATP水解為底物轉運提供能量，使轉運蛋白能夠對抗濃度梯度。P-gp起初是因為癌細胞對抗癌藥物產生耐藥性而被發現的，在許多正常上皮組織如肝微管膜、腎近端小管、胃腸黏膜、甲狀旁腺上皮細胞和胎盤、卵巢、睪丸等血組織屏障均有表達[6,7]，也在腎上腺、造血干細胞、NK細胞、抗原遞呈樹突狀細胞和T、B淋巴細胞中表達。P-gp在這些組織中頂或腔的表達使外源性物質毒性下降，減少代謝物、藥物從胃腸道的吸收，增加藥物通過膽管、尿液的排出并阻止某些藥物進入中樞神經系統[8]。P-gp在調節細胞增殖、分化、凋亡和免疫應答方面起重要作用[9]。淋巴細胞在腫瘤發生的免疫應答中起重要作用，可能是通過P-gp介導細胞因子釋放所致，包括分泌IL-2、IL-4和γ-干擾素[10]。

自從ABCB1基因被發現后，大量的病例對照研究報道了ABCB1 rs1045642與癌癥發病風險的關系，但結論并不一致[2～4]。ABCB1 rs1045642多態并不改變P-gp的氨基酸序列，但會對P-gp表達和功能產生影響。T等位基因會使癌細胞P-gp的表達或活性減弱，CC基因型比其他基因型更易使藥物外流，因而免于細胞毒性。研究[11]顯示，rs1045642 T等位基因的保護作用可能與P-gp的功能有關，可影響c-Myc、cyclin D1的功能并解除抑制細胞凋亡途徑。rs1045642 TT基因型伴有P-gp低表達，對毒素外流作用減弱，導致突變劑或毒素在細胞內濃度升高，DNA損傷、突變增加最終導致疾病進展。Jamroziak等[12]發現，rs1045642 T等位基因增加兒童急性淋巴細胞白血病的發生風險，可能是因為基因多態性使ABCB1基因表達發生量變所致。Taheri等[4]發現，TT基因型乳腺癌患者ABCB1表達明顯低于CC和CT基因型，T等位基因攜帶者發生乳腺癌的風險增加1.5倍。Oliveira等[13]發現，rs1045642多態與胃癌發病風險和進展沒有相關性。另有文獻報道，在伊朗人群中TT基因型與胃癌的發生有明顯相關性[3]。在結直腸癌患者中T等位基因攜帶者更多，TT基因型是結腸癌發生的危險因素[14]。

上述結果可能是由于ABCB1表達多樣化和組織特異性所致。實驗中P-gp檢測方法和遺傳背景不同都會影響結果。本研究對ABCB1 rs1045642多態性與食管癌發病風險相關性進行分析，結果沒有發現TT基因型與食管癌的發病風險有相關性。在健康人群中，CC基因頻率在希臘人群為0，波蘭人群為42%，中國為25%，印度為18%。rs1045642多態基因頻率與研究地區的種族明顯相關[3]。本研究對照組CC基因頻率為36.6%，比中國人群略高。盡管觀察組CC基因頻率高于對照組，但CC基因型與食管癌發病風險沒有明顯相關性。一項前瞻性病例對照研究顯示，在丹麥人群中ABCB1 rs3789243多態與結直腸癌發病風險存在正相關[15]，但把挪威和丹麥研究數據結合起來卻發現rs3789243多態與結直腸癌發生并不相關。本研究發現rs3789243、rs4148737多態與食管癌發病風險無明顯相關性，得出與其他研究不一致的結論可能與腫瘤或疾病、種族不同有關。

目前,單倍型多態性對腫瘤發生風險和臨床預后的潛在影響知之甚少。其他健康人群的單倍型分析提示，rs1045642多態位點和ABCB1基因的其他多態位點存在強連鎖不平衡[16]。rs1045642位點可能通過單倍型與ABCB1其他突變點的連鎖不平衡對治療反應產生影響。本研究分析ABCB1基因單倍型在癌癥發生中的作用，發現rs1045642 C-rs3789243 T-rs4148737 A單倍型攜帶者更不易患食管癌，這個結果提示這些多態位點相互作用并導致食管癌發病風險的降低。

本研究仍有許多局限性，如研究樣本量小，對混雜因素調整不充分，研究目標均來自食管癌高發的安陽地區，不能代表整個中國人群。

綜上所述，安陽地區ABCB1 rs1045642、rs3789243、rs4148737多態與食管癌發病風險沒有明顯相關性，但是rs1045642 C-rs3789243 T-rs4148737 A單倍型可能是食管癌的保護因素之一，下一步還需要更深入、大樣本、不同種族人群的研究驗證這一結論。