臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞最佳制備條件的研究

劉雅文

（中源協(xié)和生物細(xì)胞存儲(chǔ)服務(wù)（天津）有限公司，天津 300384）

1 UC-MSCs特性

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞通常為貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)呈梭狀或紡錘狀，相對(duì)均一[1]。根據(jù)國(guó)際細(xì)胞療法間充質(zhì)與組織干細(xì)胞委員會(huì)制定的最低標(biāo)準(zhǔn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞需滿足以下條件：（1）間充質(zhì)干細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)；（2）間充質(zhì)干細(xì)胞表型呈陽(yáng)性表達(dá)CD105-PE、CD73-PE和CD90-PE（≥95%），呈陰性表達(dá)CD45-PE，CD34-FITC，CD14-FITC或CD11b-FITC，CD79a-FITC或CD19-FITC和HLA-DR-PE（≤2%）[2]。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

（1）人臍帶樣本采集：醫(yī)生將臍帶兩端結(jié)扎，剪下放于裝有臍帶采集液的采集瓶中。（2）人臍帶組織貼壁法分離：將臍帶縱向剪開(kāi)，用鑷子剝?nèi)ツ殠е械膬筛殑?dòng)脈和一根臍靜脈，將臍帶剪成更小的小塊，勻接種于含培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶中37 ℃培養(yǎng)（即為P0代細(xì)胞）。（3）UC-MSCs傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)數(shù)天，觀察細(xì)胞形態(tài)成纖維狀且貼壁細(xì)胞占培養(yǎng)瓶底面積在85%～95%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞換液分瓶培養(yǎng)即為傳代培養(yǎng)。（傳代1次即為P1代細(xì)胞，以此類(lèi)推）

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為3組，取三份臍帶，第一組：臍帶4 ℃環(huán)境中，保存至第48 h時(shí)，進(jìn)行貼壁分離培養(yǎng)；第二組：臍帶保存在-20 ℃環(huán)境中，至第8天時(shí)復(fù)蘇，進(jìn)行貼壁分離培養(yǎng)；第三組：臍帶采集后48 h內(nèi)處理成組織塊，保存于凍存液中，液氮中保存至第25天時(shí)進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。三組分別觀察P2代、P5代細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行表型判定檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 UC-MSCs P2代細(xì)胞形態(tài)

顯微鏡下觀察臍帶組織塊周?chē)囵B(yǎng)至第12天時(shí)可見(jiàn)臍帶塊周?chē)匈N壁細(xì)胞生長(zhǎng),并開(kāi)始傳代培養(yǎng)。傳至P2代，對(duì)三組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞顯微鏡下觀察：第一組和第三組顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)細(xì)小梭形，呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，形態(tài)均一，排列整齊。第二組鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)分散雜亂，細(xì)胞數(shù)量少，形態(tài)不均一，如圖1所示。

圖1 P2代顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)

3.2 UC-MSCs P2代細(xì)胞表型判定檢測(cè)

P2代細(xì)胞表型判定檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，第一組CD105-PE低于95%第二組CD73-PE、CD105-PE均低于95%，細(xì)胞表型不合格。

3.3 UC-MSCs P5代細(xì)胞表型判定檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)至P5代細(xì)胞表型判定檢測(cè)，三組細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果均合格，見(jiàn)表2。

表1 P2代細(xì)胞表型判定檢測(cè)結(jié)果

表2 P5代細(xì)胞表型判定檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

通過(guò)分別對(duì)三組細(xì)胞進(jìn)行P2代形態(tài)上的觀察，第一組與第三組細(xì)胞由于對(duì)采集后的臍帶及時(shí)分離，細(xì)胞形態(tài)較好生長(zhǎng)較快，可見(jiàn)臍帶采集后應(yīng)盡快分離，以確保細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

通過(guò)對(duì)UC-MSCs P2代與P5代細(xì)胞表型結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，可見(jiàn)培養(yǎng)至P5代細(xì)胞相對(duì)于P2代細(xì)胞表型更加穩(wěn)定，雜細(xì)胞少，建議推薦UC-MSCs P5代細(xì)胞治療使用。

[1]翟秀巖,馬文鋒,熱海佐保子,等.培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存和解凍復(fù)蘇的操作方法[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,31(1):77-78.

[2]徐燕,李長(zhǎng)虹,孟恒星,等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其生物學(xué)特性[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(32):6289-6294.