肉色迷孔菌深層發(fā)酵培養(yǎng)條件的探究

張智超，路曉玉，孟青青，吳海英，周紅昕

（吉林省生物研究所，吉林長春 130012）

1 肉色迷孔菌

肉色迷孔菌[Daedalea dickinsii(Berk. ex Cke.)Yasuda]，別名迪金斯栓菌、扁疣菌、肉色栓菌，屬擔(dān)子菌門層菌綱非褶菌目多孔菌科迷孔菌屬，多分布在四川、云南、安徽、浙江、河南和吉林等地。子實體一年生，木栓質(zhì)，無菌柄，側(cè)生。菌蓋（4～14）cm×（6～27）cm，厚1～2cm，基部厚達3cm，半圓形，扁平或稀馬蹄形，表面有不明顯的輻射狀皺紋和環(huán)紋，或有小疣和小瘤，細(xì)絨毛，漸變光滑，初淺肉色，后變?yōu)樽鼗疑辽钭鼗疑w緣薄、鈍、全緣，下側(cè)無子實層。菌肉淡褐色、粉紅色至肉桂色，具環(huán)紋，厚3～10mm，可達20mm。菌管同菌肉色，單層，長3～20mm，管口近似蓋色，形狀不整齊，邊緣多為圓形，其他為多角形至長方形，每1～2個/mm，向邊緣漸呈長方形至迷路狀，偶爾出現(xiàn)近褶狀。管壁厚，全緣。孢子無色、光滑，近球形，5～4μm，楊、櫟、樺、胡桃等倒木、伐木樁上單生或覆瓦狀疊生。引起多種闊葉樹的木材及枕木等形成片狀或塊狀褐色腐朽。

肉色迷孔菌子實體強大的藥用價值體現(xiàn)在其實體熱水提取物對氨水抑制率為41%，對小白鼠肉瘤180的抑制率達到80%，對艾氏癌的抑制率為100%。其主要作用為抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性，基質(zhì)金屬蛋白酶為癌細(xì)胞大量繁殖所必需激活的酶介質(zhì)，故抑制基質(zhì)金屬蛋白酶就相當(dāng)于抑制癌細(xì)胞的生長，人工合成金屬蛋白酶抑制劑治療癌癥已取得初步成功。肉色迷孔菌水解產(chǎn)生的氨基酸與糖蛋白與已發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)蛋白酶組織抑制因子里面的TIMP-1結(jié)構(gòu)相似，對新型藥物-金屬蛋白酶抑制劑的研究具有極大的推動作用。

研究資料表明，深層發(fā)酵后得到的菌絲體和野生子實體相近。（1）深層發(fā)酵后得到的菌絲體在營養(yǎng)價值方面高于子實體本身。如，荷葉離褶傘菌絲體蛋白質(zhì)含量為28.3%，粗多糖為3.55%，氨基酸種類為18種，而野生子實體蛋白質(zhì)含量為21.4%，粗多糖為1.77%，氨基酸種類為17種,其發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分高于野生子實體[1]。（2）在生理機能方面以靈芝為例，靈芝子實體纖維化、木質(zhì)化程高，苦味濃，靈芝孢子細(xì)胞壁厚，不易被人體利用，而通過液體深層發(fā)酵生產(chǎn)靈芝菌絲體，產(chǎn)品苦味小，有效成分高于子實體，其菌絲體中的粗多糖及多糖含量是子實體的2.26倍和3.5倍[2]。所以，對于肉色迷孔菌這樣的藥用價值較高，子實體纖維化程度高的菌類擴繁采用深層發(fā)酵技術(shù)獲得菌絲體的方法不但可以提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，還可以彌補其子實體生理機能方面的缺點，還具有周期短、操作條件可控、降低菌體受到污染的可能性等方面的優(yōu)點。另外，液體菌種深層發(fā)酵相對于人工栽培子實體而言，能夠大大降低子實體在萌發(fā)過程中出現(xiàn)的重金屬等土壤及病蟲害帶來的污染，從源頭上減少產(chǎn)物中的雜質(zhì)。也就是說，在藥用菌子實體時，通常采用固體栽培的方式，利用木質(zhì)、草質(zhì)等原材料進行固體培養(yǎng)。但是，固體培養(yǎng)菌種生長周期長，栽培料袋滅菌率不易達到標(biāo)準(zhǔn)，這樣的培養(yǎng)方式大大制約了食藥用菌的發(fā)展。而采用液體深層發(fā)酵的方法來獲得菌絲體的方式不受這些外在因素的影響，而且能夠做到菌齡統(tǒng)一，雜質(zhì)少，純度高，操作簡單，節(jié)約勞動力，縮短栽培時間，提高產(chǎn)量進而提升產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。另外，液體深層發(fā)酵技術(shù)是現(xiàn)代化的生物技術(shù)，利用此技術(shù)可以以產(chǎn)物中獲得更多的粗多糖、多糖、氨基酸等物質(zhì)。

肉色迷孔菌深層發(fā)酵工藝，其發(fā)酵目的為獲得肉色迷孔菌的菌絲多糖及胞外多糖。研究表明，肉色迷孔菌精制胞外多糖的抗氧化能力較好[3]，而且能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。眾所周知，生物體自身在不斷地產(chǎn)生一種叫自由基的物質(zhì)，人體內(nèi)如果存在活性較高的自由基便會對人類健康造成威脅。如果人的體內(nèi)堆積了大量的自由基，就會造成蛋白質(zhì)與DNA損傷、脂質(zhì)過氧化作用等后果，進而使身體中的大部分細(xì)胞衰老、損傷、變異，引發(fā)各種疾病，免疫功能下降，包括癌癥、心血管病和各種機能性病變。近年來人們發(fā)現(xiàn)的可消除自由基的真菌多糖的種類很多，肉色迷孔菌多糖為其中效果較好的一種。另外，肉色迷孔菌的胞外多糖的抗癌活性也十分強大。癌癥是現(xiàn)今危害人類健康的主要疾病之一，肉色迷孔菌多糖抗癌活性主要是通過兩種途徑：（1）有效抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶來控制癌癥進程；（2）激活免疫細(xì)胞，增強機體抵抗癌細(xì)胞的能力，大大提高淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及網(wǎng)狀細(xì)胞的吞噬能力，從而使機體自身具有直接殺死或抑制癌細(xì)胞的增生的能力。基于肉色迷孔菌多糖的強大藥用價值，研究肉色迷孔菌發(fā)酵工藝具有深遠的意義。本文主要闡述肉色迷孔菌深層發(fā)酵條件的優(yōu)化。

2 肉色迷孔菌深層發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗

發(fā)酵工藝中，條件的優(yōu)化是提高發(fā)酵液質(zhì)量的一項重要技術(shù)手段。在發(fā)酵過程中，往往要根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的不同而制定不同的發(fā)酵工藝。控制發(fā)酵條件就是控制目標(biāo)產(chǎn)物的收率，發(fā)酵工藝中的條件包括接種量、溫度、搖床振蕩速率和培養(yǎng)液裝瓶量、pH值等。

本實驗在前期工作基礎(chǔ)上，利用搖瓶實驗對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.1%。

2.1 培養(yǎng)溫度的選擇

在500mL三角瓶中裝入150mL液體培養(yǎng)基，接種后分別在24、26、28、30℃和32℃5種不同溫度的恒溫?fù)u床中進行培養(yǎng)，搖床速率為150r/min，獲得生物量如圖1所示。

培養(yǎng)溫度可以直接影響整個發(fā)酵過程中各物質(zhì)的反應(yīng)速率及對氧的溶解度。菌體代謝過程、代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生都與培養(yǎng)溫度有著密切的關(guān)系，菌種不同其適宜的溫度也不同，所以適宜的溫度是液體發(fā)酵過程中必須考察的條件之一。

圖1 溫度對肉色迷孔菌菌絲生物量的影響

如圖1所示，肉色迷孔菌在24～32℃均可生長，在30℃時發(fā)酵液中生物量最大，可達到0.48g，因而得出結(jié)論最適培養(yǎng)溫度為30℃。

2.2 接種量的選擇

分別用2%、4%、6%、8%、10%、12%的接種量將肉色迷孔菌菌種接到500mL三角瓶150mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床30℃、150r/min的條件下進行培養(yǎng)，獲得生物量如圖2所示。

圖2 接種量對肉色迷孔菌菌絲生物量的影響

接種量對液體發(fā)酵的影響里面有一點與裝瓶量相同，就是接種量越大，溶氧量減少，進而影響發(fā)酵產(chǎn)物的合成。但接種量過小會延長發(fā)酵時間，降低發(fā)酵效率，易引起雜菌的生長。所以不同菌種接種量的大小一般取決于該菌種在發(fā)酵液中的繁殖速度。

如圖2所示，肉色迷孔菌接種量的多少與發(fā)酵液中生物量有著密切的關(guān)系，明顯看出隨接種量的增加，菌絲生物量也呈現(xiàn)出增加的趨勢，直到10%時獲得最大生物量。由此得出結(jié)論，當(dāng)接種量為10%時為最佳接種量。

2.3 轉(zhuǎn)速的選擇

將肉色迷孔菌菌種以10%的接種量接到500mL三角瓶150mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，置于不同轉(zhuǎn)速的搖床上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，天數(shù)為6天，獲得生物量如圖3所示。

圖3 搖床速率對肉色迷孔菌菌絲生物量的影響

調(diào)節(jié)搖床的振蕩速率也是發(fā)酵工藝中的重要環(huán)節(jié)。提高搖床的振蕩速率可提高培養(yǎng)液中氧的溶解速率，還可以打散菌種，這都是菌絲體生長所必需的。但如果搖床的振蕩速率過高時，也可能破壞掉生長出來的菌絲體，所以搖床速率過高時反而不利于菌絲生長。

由圖3可以看出，肉色迷孔菌菌絲生物量與搖床速率不呈遞增的線性關(guān)系，當(dāng)搖床速率為80r/min時發(fā)酵液中所獲得的生物量最大。

2. 4 pH值的選擇

將肉色迷孔菌菌種以10%的接種量接到500mL三角瓶150mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基pH值分別調(diào)成5、6、7、8，置于速率80r/min的搖床上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，天數(shù)為6天，獲得生物量如圖4所示。

圖4 pH值對肉色迷孔菌菌絲生物量的影響

發(fā)酵液的pH值是發(fā)酵過程中各種生化反應(yīng)的綜合指標(biāo)。了解菌絲體適合生長的pH環(huán)境可了解菌體的生長規(guī)律及代謝特征。

由圖4可知，發(fā)酵液中pH值對肉色迷孔菌菌絲生物量影響較大，當(dāng)pH超過6時菌絲生長速度明顯下降，pH值為7～8時幾乎不再生長。發(fā)酵液中pH值變化曲線對工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵非常重要。

2.5 裝瓶量的選擇

將肉色迷孔菌菌種以10%的接種量接到500mL三角瓶，基礎(chǔ)培養(yǎng)基裝瓶量分別為20%、25%、30%、35%、40%和45%，置于速率80r/min的搖床上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，天數(shù)為6天，獲得生物量如圖5所示。

圖5 裝瓶量對肉色迷孔菌菌絲生物量的影響

發(fā)酵過程中，在搖床一定的轉(zhuǎn)數(shù)的情況下，裝瓶量越大，溶氧會越低，蒸發(fā)量也就越少，單位發(fā)酵液所分配的動力也會越少，所以不同的菌種所適宜的裝瓶量會有所不同，但根據(jù)經(jīng)驗一般不會超過25%。

如圖5所示，肉色迷孔菌菌絲生長的速度與培養(yǎng)基的裝瓶量有關(guān)，當(dāng)裝瓶量為30%時菌絲的生物量最大，之后隨著裝瓶量的增大菌絲生物量逐漸減少，由此得出結(jié)論，培養(yǎng)基30%裝瓶量為最佳。

3 結(jié)論

本實驗通過從肉色迷孔菌子實體中分離純化菌種，正交試驗確定出液體深層發(fā)酵最適培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別進行接種量、溫度、pH、發(fā)酵液裝瓶量、搖床轉(zhuǎn)動速率的單因素試驗，試驗結(jié)果表明，肉色迷孔菌搖瓶液體培養(yǎng)的最適培養(yǎng)條件分別為接種量10%、溫度30℃、pH值6、發(fā)酵液裝瓶量150mL/500mL、搖床轉(zhuǎn)速80r/min。

[1]席亞麗,王治江,王曉琴,等.荷葉離褶傘子實體、菌絲體和發(fā)酵液營養(yǎng)成分比較分析[J].食品科學(xué),2010,31(6):155-157.

[2]趙翾.靈芝菌絲體液體深層發(fā)酵研究進展[J].食品研究與開發(fā),2011,32(12):225-228.

[3]申進文,史超文,許春平.肉色迷孔菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)分析與抗氧化活性研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,47(5):596-599.