王霽虹，任鵬，馬娜，高鏡清*

（1.清華大學附屬中學，北京100084；2.鄭州大學水利與環境學院，河南鄭州 450001）

集約化養殖業的快速發展，在帶動經濟發展和提高人民生活水平的同時，也帶來了嚴重的環境污染問題[1]。畜禽養殖廢水若不經處理直接排放，會導致河湖正常的氮循環變成“短路循環”，即氮的比例被打破，導致流域內的生態平衡被破壞。若養殖廢水長期灌溉土壤，一旦超過了土壤的自凈能力，土壤的成分和性狀將會發生改變，土壤的基本功能將會受到破壞，尤其是氮元素，從而影響植物的生長[2]。因此，修復養殖廢水污染問題已成為當前全球性環境問題的研究熱點[3]。人工濕地及生物凈化池等生態處理方法已廣泛應用于養殖廢水的污染治理中，并取得較好效果[4]。沉水植物對于人工濕地的氮去除起著重要作用，除植物本身對氮素直接吸收外，沉水植物生長過程中可以利用根系向濕地基質中釋放氧氣，改變基質的氧化還原條件，并通過提高好氧微生物的活性來增強其硝化能力，最終抑制基質中反硝化作用的發生，加速氮素由-N向其他形態的氮轉化[5]。但是，銨態氮的過量蓄積會使植物的氮素代謝功能失調，導致植物組織碳氮代謝失衡，進而引發植物其他正常生理代謝功能的紊亂[6]，并抑制其正常生長。因此，篩選出具有高銨態氮耐性的沉水植物作為凈化物種應用在養殖廢水處理工程中具有重要意義。

正常生長的植物會以較低的速率產生活性氧，但這些活性氧通常被抗氧化系統所清除，然而一旦活性氧產生超過抗氧化系統所能承受的范圍，就會發生氧化脅迫，從而導致胞質蛋白損傷、DNA損傷和脂類過氧化。當植物受到逆境脅迫時，會導致活性氧量與抗氧化系統之間的平衡被打破，活性氧上升，對植物造成損傷。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）是酶促防御系統中的三個關鍵保護酶，植物體內通過SOD、POD和CAT同工酶的相互協調配合能清除植物體內不斷產生的活性氧自由基，保護膜結構，維持代謝平衡，使植物體在一定程度上忍耐、減緩或抵抗逆境的脅迫，從而提高植物的抗逆性。

本試驗通過研究不同銨態氮濃度脅迫下耐受物種粉綠狐尾藻的丙二醛含量和抗氧化酶的相關指標的變化，探索粉綠狐尾藻對NH4+-N的耐受程度和應對脅迫時的抗氧化損傷能力；通過研究NH4+-N脅迫下植物體內MD含量與SOD、CAT和POD活性變化的關系，了解植物保護酶對高NH4+-N引發植物體內自由基毒害的保護作用機理，從而為合理地利用綠狐尾藻凈化污水提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

粉綠狐尾藻（Myriophyllumaquaticum）植株為網上購買，預培養兩周待其基本適應環境后，開始正式實驗。

1.2 實驗設計

在透明PVC塑料箱（28cm×18cm×16cm）內放入4 L配制好的營養液，底部鋪入4～5cm厚的白色石英砂。選取鮮重約1.5 g、長約10cm、生長良好、長勢一致的粉綠狐尾藻植株頂端，先用自來水清洗，再用超純水沖洗干凈，種植在塑料箱中，每箱定植20株，各單元設置參數見表1，實驗裝置如圖1所示。實驗周期為21天，植物收取間隔為7天，即取樣時間為第7天、第14天、第21天。取樣采用隨機收取，一部分植物頂端的相關生理生長指標立即進行測定，另一部分放入保鮮袋中經液氮速凍后在-80℃冰箱保存。每株粉綠狐尾藻植株截下1個頂枝作為樣品（約0.5g）測定相關指標。

表1 各培養單元參數設計

圖1 實驗裝置

1.3 測定項目及方法

膜脂過氧化水平（以MDA丙二醛含量表示）采用三氯乙酸-分光光度計法測定[7]，超氧化物歧化酶（SOD）含量的測定參照李合生的方法[8]，過氧化物酶（POD）含量的測定參照楊秀娟等[9]的方法，過氧化氫酶（CAT）含量測定采用高錳酸鉀滴定法[10]。

1.4 數據統計分析

采用Excel 2010軟件記錄數據，采用Origin8.0繪圖，結果以平均數±標準偏差（x-±s）來表示，用SPSS21.0對試驗數據進行多因素方差分析。多因素為時間因素（time）和銨態氮處理的濃度因素（treatment）。

2 結果與分析

2.1 粉綠狐尾藻在不同銨態氮濃度下丙二醛含量變化

銨態氮對粉綠狐尾藻體內丙二醛含量的影響見圖2。如圖2所示，隨著NH4+-N供應水平的增加和脅迫時間的延長，粉綠狐尾藻的丙二醛含量逐漸增加。培養時間到21天時，200、400 mg/L銨態氮濃度處理組的丙二醛含量顯著高于其他處理組，這說明隨著NH4+-N水平的提高，粉綠狐尾藻受到脅迫的程度越來越嚴重。可以認為，隨著水體中NH4+-N濃度升高，對粉綠狐尾藻造成逆境脅迫，導致體內活性氧代謝失衡，使之累積大量的膜脂過氧化產物，從而破壞植物的各項生理機能，抑制植株的正常生長。

在逆境脅迫中，植物細胞內固有的自由基代謝平衡被破壞而促進活性氧自由基的產生。過量氧自由基的毒害可加劇膜脂過氧化作用，產生膜脂過氧化產物丙二醛（MDA），從而造成細胞膜損傷，干擾植物的光合、呼吸及其他代謝過程。MDA的含量是鑒別和了解逆境脅迫對生物膜危害程度的重要指標之一。21天時，200和400 mg/L銨態氮濃度處理組的丙二醛含量顯著高于其他處理組。有研究證明，過量的銨態氮可引起植物體內MDA含量上升，且中毒程度與MDA含量成正比。MDA一旦升高，表明細胞膜脂質過氧化程度加劇，植物細胞膜系統受到破壞，即膜系統失去原有的選擇性，導致電解質的滲透和細胞水勢的下降[10]。

圖2 銨態氮對粉綠狐尾藻體內丙二醛含量的影響

2.2 粉綠狐尾藻在不同銨態氮濃度下的酶活性變化

圖3 銨態氮對粉綠狐尾藻頂端超氧化物歧化酶含量的影響

圖4 銨態氮對粉綠狐尾藻頂端過氧化物酶含量的影響

圖5 銨態氮對粉綠狐尾藻頂端過氧化氫酶含量的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是植物防御銨態氮毒害的關鍵性保護酶，具有清除活性氧自由基的功能，對于維持細胞膜的結構和功能具有重要的作用。如圖3所示，在不同銨態氮濃度處理單元（p＜0.01）和不同培養周期（p＜0.05）中，粉綠狐尾藻頂端超氧化物歧化酶的活性有顯著差異。由圖3可知，在0mg/L和25 mg/L銨態氮濃度處理組中，SOD活性在21天的培養周期內并無明顯變化；而在50mg/L和100 mg/L銨態氮濃度處理組中，粉綠狐尾藻的SOD活性呈明顯升高趨勢；在200 mg/L和400 mg/L銨態氮濃度處理組中，粉綠狐尾藻的SOD活性變化呈由低到高再降低趨勢。這可能是由于銨態氮脅迫剛開始時植物細胞中產生的過量氧自由基在SOD的正常分解能力范圍內，所以SOD活性會隨著酶底物濃度的上升而增加。

銨態氮對粉綠狐尾藻頂端過氧化物酶含量的影響見圖4。由圖4可知，對于無氮處理組（0 mg/L）和低濃度銨氮處理組（25 mg/L和50mg/L），植物POD活性隨培養時間的變化不明顯（p＞0.05），但對于高濃度銨氮400mg/L處理組，植物POD活性在培養周期內呈下降趨勢（p＞0.05）。0～7天時為植物剛受銨態氮脅迫階段，植物的抗氧化防御系統迅速被啟動，保護酶的活性迅速增加，清除過氧化產物，保護細胞膜結構和保證細胞正常代謝。但對于高濃度處理組，實驗后期部分植株葉面變黑，甚至有些植株出現萎蔫跡象，21天時粉綠狐尾藻的POD活性顯著低于培養初期。

過氧化氫酶（CAT）作為植物抵防御活性氧毒害的重要保護酶，能夠清除細胞內過多的H2O2，使細胞內H2O2維持在一個正常水平，對于保護細胞膜結構和抗御逆境脅迫具有重要意義。銨態氮對粉綠狐尾藻頂端過氧化氫酶含量的影響見圖5。由圖5可知，在環境脅迫初期，植物體內的抗氧化物質上升，亦是植物針對逆境脅迫采取的防御措施。21天時，粉綠狐尾藻的CAT活性變化趨勢與前兩種基本相同，同樣是顯著低于培養初期。

有研究表明，高濃度的銨態氮會誘導沉水植物產生氧化應激，誘導植物體內SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性發生變化。在高濃度銨態氮的脅迫下，植物體內活性氧水平升高，誘導抗氧化酶類的活性發生變化，從而清除活性氧并抵御脅迫。活性氧的水平超過抗氧化酶類的清除能力，植物體即受到了氧化損傷[11]。SOD作為防御活性氧的第一道防線，主要作用是催化O2-轉化為H2O2[12]，可消除作物體內活性氧的累積，減少其對細胞膜結構的傷害；在防御活性氧的毒性方面作用重大[13]。因此，SOD含量可以直接反映機體清除自由基能力。POD和CAT可把SOD等產生的H2O2變成H2O，催化過氧化氫與其他底物反應以消耗過氧化氫，減少過氧化氫對植物體的傷害，能夠在一定程度上反映植物的生長代謝狀況和對環境的適應性能。

本試驗表明，0～14天時，銨態氮濃度為0～50 mg/L處理組中，粉綠狐尾藻MDA含量無顯著性差異，主要原因是SOD活性顯著升高，清除了一部分過氧自由基。在銨態氮濃度為100～400 mg/L處理組中，粉綠狐尾藻MDA含量顯著升高，雖然此時SOD的活性仍然顯著升高，但過氧自由基大量蓄積，可能因為自由基產生的速率超過了SOD的清除速率。0～7天時，銨態氮濃度達到100mg/L時，POD活性顯著升高，主要是因為SOD催化過氧自由基轉化產生大量的H2O2，POD活性受到誘導從而催化轉化H2O2。銨態氮濃度達到100mg/L時，CAT活性受到抑制，可能由于積累的H2O2抑制了CAT的活性。

在實驗中，當銨態氮濃度達到200mg/L和400 mg/L時，粉綠狐尾藻的生物量在第三周出現了負增長，葉綠素含量下降，丙二醛含量顯著升高，過氧化損傷程度加劇，這說明了此時的銨態氮濃度已對綠狐尾藻的生長和生理狀況產生了直接的抑制。值得指出的是，銨態氮的耐受程度會受到實驗條件、脅迫時間和植物生長階段的變化而變化，在本試驗的研究條件下，在無氮處理組中，粉綠狐尾藻表現出營養缺乏的狀態，葉片發黃但過氧化損傷不明顯，從100 mg/L的銨態氮濃度處理組以后，粉綠狐尾藻的葉片組織出現過氧化損傷，而當銨態氮濃度達到400mg/L時，粉綠狐尾藻的葉片組織也出現損傷，根系有變黑的現象，表明其抗氧化系統受損，受到銨態氮脅迫影響顯著。

3 結論

（1）隨著銨態氮濃度從0mg/L增加到50 mg/L，粉綠狐尾藻的丙二醛含量升高不明顯。但當銨態氮濃度升至100 mg/L時，粉綠狐尾藻的丙二醛含量明顯升高，葉片組織首先表現出損傷，抗氧化酶活性隨之升高，抗氧化能力加強以抵抗銨態氮脅迫。但當銨態氮濃度升至400mg/L時，粉綠狐尾藻的葉片組織隨著實驗時間的增加也逐漸受到損傷，抗氧化能力在實驗前期增高以應對銨態氮脅迫，但在實驗中后期，粉綠狐尾藻的抗氧化能力逐漸降低，說明粉綠狐尾藻在400mg/L的銨態氮濃度處理組中受脅迫效應明顯。

（2）對于粉綠狐尾藻的抗氧化酶系統，結果表明在一定的銨態氮濃度范圍和培養周期內，SOD、POD、CAT參與了植物受脅迫進程的抗氧化調控，并通過協同作用保護葉片，降低活性氧傷害，維持植物生理功能。這說明粉綠狐尾藻具有一定的抗逆性能和適應能力，但較高濃度和較長時間的脅迫亦可使植物的生長受到抑制，抗逆性能也受到抑制，因此在高濃度氨氮處理組（200mg/L和400mg/L）MDA含量呈明顯上升趨勢。

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