間充質干細胞制劑保存穩定性探索

婁云云

（協和干細胞基因工程有限公司，天津 300384）

間充質干細胞具有自我更新和多向分化以及強烈的免疫調節功能，同時，其免疫原性低，在治療多種血液病的異基因造血干細胞移植后發生的移植物抗宿主病、自身免疫性疾病、糖尿病、克隆氏病等疾病治療中均顯示出良好效果[1-2]。臍帶間充質干細胞的來源為易得、變廢為寶的臍帶，因而受到越來越多研究者的關注，并大量從基礎研究轉入臨床應用。臨床使用細胞產品其治療的有效成分為鮮活的干細胞，就必須從其生產，保存，運輸等所有環節保證干細胞的活性，因而我們專門針對臍帶間充質干細胞制劑保存的質量參數做了試驗。

1 材料及方法

臍帶組織塊貼壁培養法分離培養人臍帶間充質干細胞，經培養提取后，置于含2%人血白蛋白、65 IU/mL低分子肝素鈣和復方電解質注射液的干細胞保存液，制成臍帶間充質干細胞注射液三批成品，標記為17121801、17121802、17121803。分別在室溫（23 ℃）和4 ℃條件下保存。并均于0、2、4、6、8、10、12 h和24 h抽樣，對其進行物理檢查和細胞存活率測定，并進行無菌檢測。

2 試驗檢測

性狀：目測應無色均勻細胞懸液，無明顯沉淀，無異物為合格。

細胞活率檢測：采用Count star自動細胞計數儀進行細胞計數；臺盼藍拒染法進行活率測定，應不低于90%。

無菌檢測：按梅里埃Bact/Alert 3D 120型全自動血培養無菌檢測系統進行檢測，上機培養7天，結果應為陰性。

計算細胞活率：細胞存活率計算采用計數300個細胞，其中活細胞所占的比率。每組重復5次，取平均值和標準差。以方差分析進行組間數據平均值統計，兩兩比較采用q檢驗。其中P＜0.05表示差異有顯著性，P＜0.01表示差異有極顯著性。

3 實驗數據結果對比

3.1 性狀、無菌檢測結果

兩種保存溫度下，不同保存時間的3批次制劑性狀均無明顯變化為合格，無菌檢測結果均為陰性。

3.2 細胞活率檢測結果

在室溫條件下，3批樣品0～6 h細胞活率降低緩慢，活率均在90%以上。而6 h之后細胞活率降低較快且低于90%，為不合格。

在4℃條件下保存24 h，細胞存活率可維持在90%以上，隨保存時間延長而逐漸降低。保存前后物理檢查及無菌檢測結果穩定，均無異常。結果詳見表1。

4 結論

3批樣品在室溫條件下保存24 h，性狀、無菌指標均無明顯變化。0～6 h細胞活率降低緩慢，且活率均在90%以上。而6 h之后細胞活率降低較快且不合格。而在4 ℃保存24 h存活率可維持在90%以上，隨保存時間延長而逐漸降低。保存前后物理檢查及無菌檢測結果穩定，均無異常。因此，可定臍帶間充質干細胞注射液保質期為24 h，保存溫度為4 ℃。

表1 細胞活率檢測結果

[1]Subbanna PK. Mesenchymal Stem Cells for Treating GVHD: in-vivo fate and Optimal Dose[J]. Med Hypotheses, 2007.69(2):469-670.

[2]Tyndall A, FA Houssiau. Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of Autoimmune Diseases[J]. Ann Rheum Dis,2010,69(8):1413-1414.