不同貯存溫度對人血白蛋白PKA影響探討

管紅玲，陳繼鋒，周仁花

（廣東衛倫生物制藥有限公司，廣東汕頭 515000）

激肽釋放酶原激活劑（prekallikrein activator，簡稱PKA）是血漿中凝血因子XII被表面激活而釋放出的激肽釋放酶限制性蛋白酶，主要含α因子XIIa及β-XIIa肽段，是一種水解蛋白[1]。PKA能激活激肽釋放酶原（PK）使其轉變為激肽釋放酶K后水解了高分子激肽原（HMWK），并釋放出具有生物活性的激肽（BK）。BK具有導致局部疼痛，引起水泡、呼吸加速，尤其突出的臨床反應是具有舒緩、擴張血管降低血壓的作用[1]。人血白蛋白的臨床主要應用于嚴重失血性創傷及燒傷所引起的低血容量休克，治療腎病或白蛋白缺乏所引起的水腫等。當人血白蛋白中的PKA含量過高時或不合格，會在輸注時出現血壓下降的不良反應[2]。所以PKA是血液制品生產工藝中必須控制的質量指標，以確保患者的用藥安全，《中國藥典》人血白蛋白的PKA控制標準≤35IU/mL[3]。

PKA的產生是開始采集血漿時啟動，凝血反應也隨即產生，而添加的枸椽酸鈉抗凝劑未跟血液充分混勻，使用的器具未硅化等，人血漿在冷鏈運輸、貯存溫度不當引起反復凍融、以及在生產控制過程過于追求產量而雜質高都將提高PKA水平[4]。本文設計了PKA對熱敏感性研究，并將3組樣品分別放置在2～8℃、20～25℃、29～31 ℃條件下貯存，以研究不同貯存溫度對PKA的影響，為人血白蛋白控制PKA含量設計工藝研發路線、設計產品貯存條件及運輸溫度提供參考依據。

1 試驗儀器和材料

1.1 樣品加溫、檢測設備

1.1.1 恒溫水浴鍋

型號：CS501-3C；溫度范圍：R.T +5～95℃；溫度波動度：±0.5℃；廠家：北京衛星制造廠；要求：應對恒溫水浴鍋進行校準，溫度波動度在±0.5℃范圍內，在校準有效期內使用；用途：對樣品進行62℃、2h，63℃、2.5h的恒溫。

1.1.2 酶標儀

型號：ELx800；精度范圍：分辨率為0.001 OD，線性≥0.99，OD重復性為±0.005 OD（即≤0.010 OD），OD準確性為±0.010 OD（即≤0.020 OD），波長范圍為400～750 nm，動態范圍0～3.0 OD；廠家：美國伯騰儀器有限公司；要求：應對酶標儀進行校準，在校準的有效期內使用；用途：檢測血液制品的激肽釋放酶原激活劑PKA含量。

1.1.3 二等標準水銀溫度計

測量范圍：-30～20℃；精密度：0.1℃；廠家：常州雙環熱工儀表有限公司。

1.2 檢測試劑

激肽釋放酶原激活劑（PKA）國家標準品（中國藥品生物制品檢驗所），前激肽釋放酶（PK）試劑（成都協和生物技術中心），激肽釋放酶顯色底物（S-2302）。

1.3 檢測方法

采用顯色底物法（或顯色基質法）測定[3]。

1.4 樣品要求

本次研究的樣品是由廣東衛倫生物制藥有限公司生產，是以合格的單人份血漿為原料，采取經典的Cohn低溫乙醇法中提取人血白蛋白，通過超濾脫醇、添加辛酸鈉保護劑配制成為20%（10g）蛋白質溶液，通過60℃、10h及除菌灌裝在50mL玻璃瓶中再經29.5～30.5℃孵育14天即為研究樣品。

1.5 恒溫室要求

1.5.1 三星冰箱

溫度控制：2～8℃；設置溫度：5℃，上限設置為7℃，下限設置為3℃。

1.5.2 藥品穩定性實驗箱（2個）

設備型號為LHH-150SD，溫度偏差≤±1.0℃，濕度偏差≤±3.0%，溫度均勻度≤1.0℃，濕度均勻度≤5.0%。

2 方法

2.1 方法設計

廣東衛倫生物制藥有限公司人血白蛋白貯存溫度2～30℃，有效期3年。故本次研究將人血白蛋白完成從原料血漿投料至超濾脫醇后配制成半成品，經60℃、10h巴氏滅活開始設計PKA對熱敏感研究方案，分別設計了2～8℃、20～25℃、29～31℃貯存條件。本次設計了A、B、C三組樣品考察，2～8℃樣品放置在冰箱，20～25℃、29～31℃樣品放置在穩定性實驗箱，分別考察36個月。

2.1.1 A組

取3批人血白蛋白在完成60℃、0h巴氏滅活前（A1樣品）、60℃、10h巴氏滅活后（A2樣品），產品除菌灌裝（A3樣品）并經29.5～30.5℃孵育14天為0月計分別取樣檢測PKA含量，將3批樣品放置在2～8℃中，并分別于3個月、6個月、9個月、12個月、18個月、24個月和36個月取出樣品檢測PKA含量，對檢測結果進行統計分析。

2.1.2 B組

取3批人血白蛋白在完成60℃、10h巴氏滅活前（B1-1/B2-1）、60℃、10h巴氏滅活后（B1-2/B2-2），除菌灌裝后（B1-3/B2-3）并經29.5～30.5℃孵育14天為0月計分別取樣檢測PKA含量，將3批樣品放置在20～25℃（B1）、29～31℃（B2）穩定性實驗箱中，并分別于3個月、6個月、9個月、12個月、18個月、24個月和36個月取出樣品檢測PKA含量，對檢測結果進行統計分析。

2.1.3 C組

取3批人血白蛋白在完成60℃、10h巴氏滅活（C1-1/C2-1樣品），除菌灌裝后（C2組）取樣品放置在CS501-3C恒溫水浴鍋62℃恒溫2h[4]（C1-2/C2-2樣品），經29.5～30.5℃孵育14天計為0月（C1-3/C2-3樣品）。分別取樣檢測PKA含量，將3批樣品經放置20～25℃（C1樣品）、29～31℃（C2樣品）穩定性實驗箱中，并分別于3個月、6個月、9個月、12個月、18個月、24個月和36個月取出樣品檢測PKA含量，對檢測結果進行統計分析。

2.2 PKA檢測方法

采用顯色底物法，用紫外-可見分光光度法在波長405 nm處測定供試品吸光度，計算PKA含量[3]。

3 結果與分析

3.1 A組結果

A組設計方案從表1可見，人血白蛋白在經60℃、10h巴氏滅活后較滅活前的PKA值平均下降了43.5%，但經29.5～30.5℃孵育14天后較滅活后PKA值平均回升50%，在2～8℃貯存36個月考察期間，PKA控制值出現緩慢上升又下降趨勢，但均符合國家標準≤35IU/mL，結果表明60℃、10h巴氏滅活及貯存溫度、時間對控制PKA是一定有影響。

從A組結果中可見人血白蛋白在經60℃、10h巴氏滅活后較滅活前、以及在經29.5～30.5℃14天孵育后較滅活后的PKA值控制值有下降及回升的過程。

3.2 B1、B2組方法結果

3.2.1 B1組結果

將樣品放置在20～25℃貯存考察36個月按表2取樣周期分別檢測PKA值，可見PKA控制值出現緩慢上升又下降趨勢（見圖1），分水嶺在3個月開始逐漸下降，并均符合國家標準≤35IU/mL，結果表明60℃10h巴氏滅活、提高貯存溫度可降低PKA值。

圖1 B1組方案人血白蛋白PKA結果（貯存條件20～25℃）

3.2.2 B2組結果

將樣品放置在29～31℃貯存36個月考察期間按表3取樣檢測PKA值，出現PKA控制值緩慢上升又下降趨勢(見圖2)，分水嶺在3個月開始逐漸下降，并均符合國家標準≤35IU/mL，結果表明60℃、10h巴氏滅活、提高一定的貯存溫度可降低PKA值。

圖2 B2組方案人血白蛋白PKA結果（貯存條件29～31℃）

表1 A組方案人血白蛋白PKA結果（貯存條件2～8℃）(單位：IU/mL)

表2 B1組方案人血白蛋白PKA結果（貯存條件20～25℃）(單位：IU/mL)

表3 B2組方案人血白蛋白PKA結果（貯存條件29～31℃）(單位：IU/mL)）

3.3 C1組、C2組方法結果

3.3.1 C1組方法結果

從表4、圖4可見，人血白蛋白在經60℃、10h巴氏滅活繼續進行62℃、2h較滅活前的PKA值平均下降了82.6%，但經29.5～30.5℃孵育14天后較滅活后PKA值平均回升150%，樣品放置在20～25℃貯存36個月考察期間按表4取樣檢測PKA，發現PKA同樣出現緩慢上升又下降趨勢見圖3，并在3個月開始逐漸下降，并均符合國家標準≤35IU/mL，結果表明提高巴氏滅活溫度、延長滅活時間、提高貯存溫度可明顯降低PKA含量。

圖3 C1組方案人血白蛋白PKA結果

圖4 C組方案人血白蛋白PKA結果（貯存條件29～31 ℃）

表4 C1組方案人血白蛋白PKA結果（60℃10h+62℃2h貯存條件20～25℃）(單位：IU/mL)

表5 C2組方案人血白蛋白PKA結果（60℃10h+62℃2h貯存條件29～31℃）(單位：IU/mL)

3.3.2 C2組方法結果

從C1級方案可見人血白蛋白在經60℃10h巴氏滅活繼續62℃2h較滅活前、經29.5～30.5℃孵育14天后較滅活后的PKA值有大幅度的下降及回升趨勢，樣品放置在29～31℃貯存36個月考察期間按表5取樣檢測PKA值，PKA控制值同樣出現緩慢上升及下降趨勢（見圖4），并在3個月開始出現下降趨勢，并均符合國家標準≤35IU/mL，結果表明在同等巴氏滅活條件下、延長滅活時間、提高一定貯存溫度可明顯降低PKA含量。

4 討論

A組、B組研究結果表明血漿中的PKA在經過60℃高溫后平均可以滅活43.5%PKA，但進行29.5～30.5℃孵育14天工序后PKA水平較巴氏滅活后增加了50%。C組結果表明當60℃10h巴氏滅活再繼續62℃2h加溫后PKA含量較A組、B組平均下降60%水平，但同樣進行29.5～30.5℃孵育14天工序后PKA水平較巴氏滅活后增加了150%。陳通威等報道[4]，PKA對熱非常穩定，60℃或提高溫度或時間無法有效滅活PKA。

通過對人血白蛋白36個月PKA水平的考察發現，A組在2～8℃貯存過程中PKA含量在逐漸上升直至30個月后，PKA方有下降趨勢，證實了Suontaka 等[5]報道，輸血用血漿在4℃保存期間發生冷激活，在冷激活中激肽釋放酶樣活性增加。B1組、B2組分別在20～25℃、29～31℃貯存過程中PKA含量3個月內在逐漸上升，3～9個月有一個水平平穩過程后又逐漸下降。C1組、C2組的研究結果也證實了這一點。也就是說通過高溫后的PKA未能有效滅活，但產品貯存在20～30℃激肽釋放酶的活性在降低。從考察結果來看，B組與C組PKA水平實際上無明顯差異。

控制血漿中PKA水平應該從原料血漿的采集、嚴格控制運輸及貯存溫度、控制好生產過程反應溫度及PH值，也可采取硅藻土吸附的方法[6]。采取巴氏滅活、提高巴氏滅活溫度或延長時間的方法來降低PKA水平，會對蛋白質的穩定性和純度有一定的影響[7]。

綜上所述，人血白蛋白中PKA選擇適宜的貯存溫度可降低未能滅活的PKA含量，本次研究為衛倫生物制藥有限公司制定控制PKA生產工藝路線、設計原料血漿及產品運輸、貯存溫度，提高產品質量的目的具有很大的意義。

[1]潘傳涌,時多,繆明永,等.激肽系統活性產物[J].生命的化學,2008,28(5):629-632.

[2]王卓,趙雄,呂茂民,等.血液制品的現狀與展望[J].生物工程學報,2011,27(5):730-746.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010.

[4]陳通威,胡明明.降低人血白蛋白制品中PKA方法初探[J],中國醫藥生物技術,2013,8(6):463-465

[5]Suontaka AM, Silveira A, S?derstr?m T, et al. Occurrence of cold activation of transfusion plasma during storage at +4 ℃[J]. Vox sang,2005,88(3):172-180.

[6]周滿祥,楊向明,申云飛,等.人血白蛋白制品中激肽釋放酶原激活劑的控制方法:中國,CN103087184A[P].2013-05-08.

[7]吳敬林.不同條件巴氏消毒和熱穩定性試驗對人血白蛋白多聚體的影響[J].醫學雜志,2000,9(6):874-875.