一株滸苔拉烏爾菌HT15-8的菌種鑒定及其抗腫瘤活性初步研究

苑志欣，李榮貴，鄭蘭紅

（1.青島大學 生命科學學院，山東青島 266071；2. 農業農村部極地漁業開發重點實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島 266071）

海洋微生物作為抗腫瘤活性物質的新來源，已經 受到了全世界海洋研究工作者的關注。滸苔是一種重要的海洋資源，含有豐富的碳水化合物、氨基酸、微量元素、維生素和脂肪酸等營養物質，具有降血糖、抗菌消炎、抗腫瘤活性、提高免疫力的作用[1]。本研究采用細胞毒活性檢測法，從滸苔共生菌中篩選出一株具有抗腫瘤活性的菌株Raoultella sp. HT15-8，對其次級代謝產物進行了初步的分離純化，得到的抗腫瘤粗提物對兩種腫瘤細胞都具有良好的抗腫瘤活性。本文結合具體實驗與分析方法作一探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養基

Raoultella sp.HT15-8，由本實驗室從青島海域的滸苔中分離得到。發酵培養基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH=7.5，121 ℃滅菌30 min。

1.1.2 細胞培養

人肝癌細胞BEL-7402、人非小細胞肺癌細胞A549均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；人肝癌細胞BEL-7402細胞采用DMEM高糖培養基，人非小細胞肺癌細胞A549采用RPMI1640培養基；將各腫瘤細胞接種于含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM、RPMI1640培養 液 中，置 于37 ℃、5%CO2培養箱內培養。

1.1.3 主要試劑

RPMI1640、DMEM、PBS、胰蛋白酶、進口胎牛血清、DMSO，購自Solarbio公司；16S rRNA通用引物，由上海生工生物工程有限公司合成；PCR擴增相關試劑和核酸Marker，購自索萊寶生物工程公司；MTT，購自Sigma公司；微孔濾膜，購自美國Pall公司；甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、Tris、鹽酸等常用試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為超純水和蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

從青島海域撈取新鮮滸苔瀝干，將其研磨粉碎成漿，分別采用海水基礎培養基2216E、LB培養基和牛肉膏蛋白胨培養基等對滸苔樣品進行多次選擇性的稀釋、涂布、劃線和分離培養，共獲得10株單菌落。

1.2.2 菌種鑒定

（1）形態觀察。將活性初篩得到的HT15-8接于牛肉膏蛋白胨平板上，30 ℃靜置培養24 h后，體式顯微鏡下觀察菌落及子實體形態。

（2）生理生化特征觀察。采用API 20E腸桿菌和其他革蘭陰性桿菌鑒定系統和API 20NE非腸道革蘭陰性桿菌鑒定系統和氧化酶試紙測定生理生化特征。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察活性組分對細胞形態的影響

取對數生長期的細胞，將細胞制成濃度為4×104個/mL的細胞懸液，均勻鋪在96孔培養板中，每孔加入180 μL，置于CO2恒溫培養箱中37 ℃培養24 h。參考MTT實驗結果加樣，4個平行孔，每孔加入20μL樣品，對照組加入無菌水，在37 ℃恒溫培養箱中繼續培養12 h、24 h、36 h后，取出放置在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，并拍照記錄。

1.2.4 活性粗提物的分離純化

（1）菌株的發酵培養。將實驗室保藏的菌株HT15-8先轉接到固體培養基活化后，用接種環挑取單菌落接種于4 mL種子培養基中，于30 ℃、200 r/min的搖床中恒溫培養12 h，即為種子培養液；然后按照4%的接種量將活化后的種子培養液轉接于含發酵培養基400 mL的大搖瓶中，離心去菌體收集上清發酵液。

（2）有機溶劑萃取。將各菌株發酵液在12 000 r/min條件下離心20 min后收集上清液，超濾濃縮后加入等體積的有機溶劑甲醇、丙酮、乙酸乙酯、水飽和正丁醇進行萃取，每次萃取4 h，多次萃取后收集上層有機相，然后利用旋轉蒸發儀將收集到的萃取相在60 ℃條件下減壓蒸干。減壓蒸干的樣品經重溶、離心、凍干后，檢測發酵活性組分的抗腫瘤活性。

（3）離子交換色譜分離。將得到的活性組分用盡量少的Tris-HCl緩沖液復溶后，進行離子交換色譜分離。采用陽離子交換色譜柱CM柱進行交換分離，將收集到的樣品進行透析除鹽凍干，分別測定其細胞毒活性。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

初篩實驗表明，對肝癌細胞BEL-7402的抑制率達到50%以上的滸苔共生微生物有4株，其中HT15-8菌株的發酵液具有最強的腫瘤細胞增殖抑制作用，并將該菌株于2016年9月30日保藏于中國武漢典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCM2016507。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態特征

HT15-8菌落呈圓形，表面光滑濕潤，易挑起，菌落質地均勻，正反面、邊緣以及中央部分的顏色很均一，菌落顏色為乳白色，屬于革蘭氏陰性菌。

2.2.2 生理生化特征

HT15-8的生理生化特征實驗結果見表1，脲酶、色氨酸脫氫酶、明膠酶均顯示陰性；β-半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、H2S產生、吲哚實驗、VP實驗、氧化酶試驗均顯示陽性。

表1 Raoultella sp. HT15-8菌株的生理生化特征

2.2.3 系統發育樹的構建

對HT15-8進行瓊脂糖凝膠電泳，結果有亮色條帶出現，說明PCR成功，可用于后續測序。在NCBI上經過BLAST分析，結果表明HT15-8屬于拉烏爾菌屬，命名為Raoultella sp. HT15-8，與Raoultella planticola ATCC 33531在同一分支上，在進化位置上最為接近。利用Mega 6.0的Kimura-2-Parameter模型，運用鄰接法（NJ）構建系統發育樹。

2.3 活性粗提物的純化

2.3.1 萃取分離

菌株HT15-8發酵液經不同有機溶劑萃取后，對BEL-7402腫瘤細胞進行細胞毒活性檢測，其中甲醇、丙酮和乙酸乙酯對發酵液中目的產物的抗腫瘤活性影響較大，而正丁醇對發酵上清液的抗腫瘤活性影響較小，可以很好地將目的產物萃取出來。

萃取組分300μg/mL 甲醇 甲醇 正丁醇 乙酸乙酯抑制率/% 21 13 74 22

2.3.2 離子交換色譜分離抗腫瘤活性物質

將萃取得到的粗提物用盡量少的水復溶后，進行離子交換色譜分離。分別用陰離子交換色譜HiTrap DEAE FF、HiPrep Q FF 16/10和陽離子交換色譜HiTrap CM FF置換分離，結果顯示陽離子色譜HiTrap CM FF可以較好地將目的產物置換出來。得到的分離結果如圖1，共收集到3個穿透峰，只有峰P3的凍干液有活性。

圖1 離子交換色譜分離抗腫瘤活性組分

2.3.3 粗提物的抗腫瘤活性

將HiTrap CM FF離子交換色譜所分離得到的活性粗提物濃縮成一定濃度，分別作用于BEL-7402和A549，無菌水作為陰性對照，相同條件下作用24 h后，可以觀察到對照中的腫瘤細胞正常生長，不受任何影響。而加藥組的腫瘤細胞增殖受到抑制，均出現變圓皺縮聚團現象，同時部分細胞還出現裂解凋亡狀態。

圖3 活性粗提物對BEL-7402和A549作用24h后的形態變化

3 討論

隨著人們生活質量的提高和對身體健康的日益重視，對于開發高效、低毒的小分子抗腫瘤藥物的需求也變得日益迫切。本實驗以滸苔為研究對象，對10株滸苔共生微生物進行發酵培養，采用細胞毒活性（MTT）法，對代謝產物進行了抗腫瘤活性的重點篩選，從倒置顯微鏡下觀察分析發現，滸苔拉烏爾菌Raoultella sp. HT15-8代謝產物的活性組分能夠明顯抑制腫瘤細胞的正常增殖并最終導致其凋亡[2]。通過對菌株HT15-8進行形態觀察、生理生化實驗鑒定和16S rRNA基因序列同源性分析，發現為拉烏爾菌屬（Raoultella sp.），通過倒置顯微鏡觀察菌株Raoultella sp. HT15-8代謝產物的活性組分對 BEL-7402、A549細胞形態的影響，結果顯示株菌HT15-8的活性組分可以改變腫瘤細胞形態，抑制腫瘤細胞增殖。

進一步采用水飽和正丁醇萃取制備滸苔微生物的代謝產物，隨后通過陽離子交換色譜HiTrap CM FF對該粗提物進行蛋白分離純化，得到1個較純的單峰物質，體外腫瘤細胞實驗結果顯示該組分具有廣譜高效的抗腫瘤活性。該實驗表明，HT15-8有開發成抗腫瘤新藥物的潛在價值，為新型先導化合物的發現提供了新的微生物種質資源。

[1]曹雪,楊瑞麗,袁獻溫,等.海洋放線菌ACMA006抗腫瘤活性成分的分離純化及結構鑒定[J].臺灣海峽,2011，30(3):400-404.

[2]孫坤來,王義,付鵬,等.滸苔共生真菌HT-2次生代謝產物的研究[J].中國海洋藥物,2013,32(1):37-45.