人用狂犬病疫苗凍干保護(hù)劑篩選研究

劉瑩

（寧波榮安生物藥業(yè)有限公司，浙江寧波 315800）

狂犬病是一類由病毒導(dǎo)致的病癥，引發(fā)狂犬病的病毒被稱為狂犬病病毒，具有致死率高、潛伏期長兩大顯著特點(diǎn)。事實(shí)上，狂犬病也并非想象中的那樣恐怖，通過有效措施和手段完全可以得到預(yù)防，預(yù)防狂犬病可以從以下三方面著手：（1）一旦被犬類咬傷后，應(yīng)立即清洗傷口，為傷口消毒；（2）提前按規(guī)定在相關(guān)醫(yī)療機(jī)構(gòu)接種狂犬病疫苗；（3）被犬類咬傷后，在不知其是否為病犬的情況下均到相關(guān)醫(yī)療機(jī)構(gòu)注射抗狂犬病病毒血清或狂犬病免疫球蛋白[1-2]。

目前，市面上在售的預(yù)防狂犬病類的疫苗品種繁多，但劑型主要集中在液體制劑和凍干制劑兩種劑型，其中狂犬病疫苗凍干粉針劑型具有液體制劑所無可比擬的優(yōu)勢(shì)，值得大力推廣，其優(yōu)勢(shì)主要集中在運(yùn)輸和儲(chǔ)存兩個(gè)方面。低溫真空冷凍干燥技術(shù)作為一項(xiàng)廣泛應(yīng)用的制藥工程技術(shù)，其包括冷凍、升華、干燥等一系列復(fù)雜的工序，在整個(gè)工藝流程中各個(gè)參數(shù)必須被精準(zhǔn)、完美地控制好才能制造出符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的合格疫苗[3-4]。但是，在步驟繁多的凍干工藝過程中，各種極端的低溫、凍結(jié)、干燥條件都會(huì)一定程度的破壞疫苗制品中的蛋白質(zhì)；因此，為了保證凍干疫苗制品的良好品質(zhì)需要在凍干工藝中加入一定的凍干保護(hù)劑；此外，本文所介紹的狂犬病疫苗表面具有刺突狀糖蛋白，該刺突狀糖蛋白極易脫落；在凍干工藝中添加合適的凍干保護(hù)劑可以防止其脫落，保證凍干狂犬病疫苗的穩(wěn)定性及免疫原性[5-6]。

以上介紹了凍干狂犬病疫苗凍干工藝中凍干保護(hù)劑的重要性，但選擇合適的凍干保護(hù)劑更是需要討論和重視的問題，其在很大程度上決定了可凍干狂犬病疫苗的成品品質(zhì)。經(jīng)查閱大量相關(guān)凍干疫苗生產(chǎn)凍干保護(hù)劑工藝類文獻(xiàn)和收集大量相關(guān)配方、專利，并經(jīng)過多次小試研究，最終確定了以葡萄糖、右旋糖酐、乳糖、山梨醇、明膠為凍干狂犬病疫苗保護(hù)劑主成分的保護(hù)劑配方，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此配方中的主要影響因素，葡萄糖、右旋糖酐、明膠不同含量組合的保護(hù)效果進(jìn)行比較，篩選最適配方。

1 材料與方法

1.1 疫苗原液

疫苗原液自行制備，狂犬病疫苗應(yīng)用Vero細(xì)胞培養(yǎng)制備。

1.2 主要試劑

葡萄糖（廠商：Sigma，規(guī)格：100 g/瓶）、右旋糖酐（廠商：Sigma，規(guī)格：10 g/瓶）、乳糖（廠商：上海沃凱試劑有限公司，規(guī)格：10 g/瓶）、山梨醇（廠商：上海滬試試劑有限公司，規(guī)格：25 g/瓶）、明膠（廠商：上海滬試試劑有限公司，規(guī)格：500 g/瓶）。

1.3 供試液制備

以葡萄糖、右旋糖酐、乳糖、山梨醇和明膠為凍干狂犬病疫苗保護(hù)劑主成分的固定保護(hù)劑配方，改變葡萄糖、右旋糖酐、明膠的含量，制定6種保護(hù)劑配方，供試液為此6種保護(hù)劑配方分別與原液以1∶1的比例混合均勻，具體保護(hù)劑配方如下：（1）5%葡萄糖、3%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和1%明膠；（2）4.5%葡萄糖、3%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和1.2%明膠；（3）3.5%葡萄糖、2.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和2%明膠；（4）5%葡萄糖、3.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和2%明膠；（5）4.5%葡萄糖、3.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和2.5%明膠；（6）5%葡萄糖、3%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和2%明膠。

1.4 半成品的分裝凍干及成品檢測(cè)

將配制的6批半成品分裝至西林瓶中，0.5 mL/瓶，以同一凍干曲線進(jìn)行凍干。對(duì)凍干后的成品進(jìn)行外觀檢測(cè)，外觀合格的成品檢測(cè)其效力和熱穩(wěn)定性，并檢測(cè)其對(duì)應(yīng)的半成品的效力，計(jì)算效力下降比率；同時(shí)根據(jù)2015版《中國藥典》第三部的要求對(duì)成品進(jìn)行pH值、水分、Vero細(xì)胞DNA殘留量、牛血清白蛋白含量、細(xì)菌內(nèi)毒素、異常毒性及無菌檢測(cè)，依據(jù)各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果確定最佳的凍干保護(hù)劑配方。

1.5 凍干保護(hù)劑的適用性驗(yàn)證

應(yīng)用篩選的最佳凍干保護(hù)劑配方制備6批半成品，并進(jìn)行凍干制備成品，按規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 凍干保護(hù)劑的長期穩(wěn)定性驗(yàn)證

對(duì)以上6批成品進(jìn)行長期穩(wěn)定性考察，考察調(diào)節(jié)為4 ℃冷藏，0月、6月、12月為考察時(shí)間節(jié)點(diǎn)，取樣按規(guī)定進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 成品的檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 外觀

僅從外觀來看，6批成品中有3批不合格、3批合格；3批不合格成品（批號(hào)4、5、6）的外觀主要呈現(xiàn)凍干塊萎縮、凹陷成窩、裂痕明顯等；3批合格成品（批號(hào)1、2、3）的外觀主要呈現(xiàn)為凍干塊白色疏松有序，通過進(jìn)一步復(fù)溶試驗(yàn)，結(jié)果顯示復(fù)溶速度快，溶液澄清透明，無雜質(zhì)。

2.1.2 效力試驗(yàn)及相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目

對(duì)比3批合格成品（批號(hào)1、2、3）凍干前后效力下降水平，批號(hào)1凍干前后效力下降約16.3%，批號(hào)2凍干前后效力下降約19.3%，批號(hào)3凍干前后效力下降約50%。進(jìn)一步對(duì)批號(hào)1、批號(hào)2進(jìn)行熱穩(wěn)定試驗(yàn)，批號(hào)3由于凍干后效力下降過大已被排除。隨后對(duì)批號(hào)1、批號(hào)2進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢測(cè)項(xiàng)檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)均合格。

2.1.3 凍干保護(hù)劑的篩選

批號(hào)1和批號(hào)2變量凍干保護(hù)劑配方分別為葡萄糖5%、右旋糖酐3%、明膠1%和葡萄糖4.5%、右旋糖酐3%、明膠1.2%；批號(hào)1和批號(hào)2成品所有檢測(cè)項(xiàng)均合格，基于生產(chǎn)配樣效率考慮，選擇配方1為最佳保護(hù)劑配方（3.5%葡萄糖、2.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇、2%明膠）。

2.2 凍干保護(hù)劑的適用性

以最佳凍干保護(hù)劑配方配制6批半成品凍干過程效價(jià)平均下降6.9%，熱穩(wěn)定效力下降14.8%，無論是凍干后還是熱穩(wěn)定性試驗(yàn)后的效力均大于2.5 IU/劑，其他檢測(cè)指標(biāo)均合要求。

2.3 凍干保護(hù)劑的長期穩(wěn)定性

6批成品的效價(jià)在12個(gè)月內(nèi)無大幅下降，效價(jià)較穩(wěn)定，均大于2.5I U/劑，其他檢測(cè)指標(biāo)均符合要求。

3 結(jié)論

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人畜共患病。狂犬病病毒屬于彈狀病毒科狂犬病毒屬，其主要起效用的抗原是位于病毒表面包膜上的糖蛋白；該蛋白在形態(tài)上內(nèi)嵌于病毒主體，形成一個(gè)個(gè)凸起。為了保證狂犬病病毒的穩(wěn)定性、有效性，狂犬病病毒疫苗最好的成藥方式是制成凍干粉針制劑，該劑型是狂犬病疫苗行業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)[7-8]。目前，全球應(yīng)用得最為廣泛的狂犬病疫苗品種均是凍干粉針劑型。

表1 6批成品檢測(cè)結(jié)果

真空低溫冷凍干燥特別適合一些對(duì)熱敏感的物質(zhì)，疫苗就是一類對(duì)熱敏感的物質(zhì)；不僅如此，凍干技術(shù)還可以最大程度的保持疫苗的活性和結(jié)構(gòu)[9]。本研究旨在確定最佳的凍干保護(hù)劑配方，同時(shí)保證疫苗的效力及其他各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。最終確定了3.5%葡萄糖、2.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇、2%明膠的最佳凍干保護(hù)劑配方。

葡萄糖能夠降低凍干過程對(duì)病毒包膜的傷害作用，葡萄糖的羥基與蛋白質(zhì)中的極性基團(tuán)形成氫鍵，從而代替蛋白質(zhì)極性基團(tuán)周圍和磷脂中的水分子，使蛋白質(zhì)周圍形成水化膜，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)因凍干而變性，使疫苗在低溫冷凍和干燥失水的情況下，仍保持結(jié)構(gòu)與功能的完整性。右旋糖苷在凍干制劑中起到支架作用，使凍干制品外觀呈白色疏松體。試驗(yàn)中批號(hào)4、5、6配方中右旋糖酐含量較低，在該配方中作為支架的濃度不夠，因此凍干后外觀不合格。在應(yīng)用明膠的可降解性時(shí),經(jīng)常對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾,調(diào)控其降解速度以適應(yīng)不同的需要。明膠于能抑制病毒聚集而使病毒穩(wěn)定，通過影響水分子的構(gòu)象加強(qiáng)與蛋白質(zhì)的疏水作用，抵抗熱變性，使蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定。明膠上的羥基能與病毒蛋白外殼中的羰基或氨基結(jié)合，能形成玻璃樣結(jié)晶顆粒，有效保持病毒外殼的空間構(gòu)型，從而保持疫苗的活性。

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[2]姚亞夫,張卓光,王洪彬,等.提高麻疹乙腦二聯(lián)活疫苗熱穩(wěn)定性的研究[J].中國生物制品學(xué)雜志,2016,11(1):25-28.

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[6]耿錕錕,熊非,朱家壁,等.用于藥物制劑的冷凍干燥技術(shù)及相關(guān)影響因素[J].藥學(xué)進(jìn)展,2011,35(3):104-109.

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