單小娥，張發宇，余金衛，汪家權

（合肥工業大學資源與環境工程學院，安徽合肥 230000）

螺旋藻（Spirulina Sp.）是近年來已經規模化培養的單細胞螺旋絲狀藍藻，其蛋白質含量高達60%～70%。由于螺旋藻營養豐富，并且富含多種藥物特性，引起了人們的廣泛關注[1]。鈍頂螺旋藻（Spirulinaplatesis）是螺旋藻中營養成分最高的一類，具有高蛋白、低脂肪、多種維生素的特點，其中的藻膽蛋白是一種天然食用色素，能夠提高淋巴細胞的活性，增強人體免疫力[2]，因此常被用來作蛋白提取的材料。

別藻藍蛋白（APC）是藻膽蛋白的一種，在科學研究、醫學、工業中具有廣泛的應用前景。事實證明，APC作為熒光探針優于其他的藻膽蛋白，因為APC的最大激發峰和發射峰位于紅光區，而大多數的生物材料在紅光區無發射峰，這樣就避免了相互之間的干擾[3]。同時，APC還可以作為食品中的色素添加劑以及醫學中的光敏劑和抗腫瘤物質[4]。研究發現，APC對腸病毒71感染猴腎細胞誘導的細胞病理反應具有明顯抑制作用[5]。

APC純化的方法通常涉及凝膠過濾色譜和離子交換層析的組合，但耗時，并且不適于分離大量的材料[6-7]，離子交換層析使用離子強度梯度洗脫也會帶來高離子強度的問題。羥基磷灰石可以高效提取高純度APC，由于APC和CPC的表面電荷性質不同，它們與羥基磷灰石結合的能力也不同。在適當的緩沖液中，羥基磷灰石選擇性地僅吸附APC而不吸附CPC[8-9]。

本文采用硫酸銨分級粗提純結合羥基磷灰石柱層析法從鈍頂螺旋藻粉中分離純化出APC，并對工藝條件進行了優化選擇，建立了一個快速、高效的純化APC的方法，并對純化液進行紫外-可見吸收光譜掃描，運用光譜學的基本原理分析了該純化工藝方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鈍頂螺旋藻粉，用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液溶解至含水率約為96.5%。

1.2 儀器與試劑

儀器：紫外-可見分光光度儀、低溫高速離心機、恒溫磁力攪拌器、電子天平、冷柜、QuickSep中高壓層析系統、Vantage-L層析柱。

試劑：硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、CHT-B型羥基磷灰石。

1.3 實驗方法

（1）藻膽蛋白的粗提。反復凍融3次后過4層普通20目紗布，離心得到藻膽蛋白粗提液。

（2）藻膽蛋白的硫酸銨分級純化。向粗提的藻膽蛋白中加入濃度為A（1.2～2.0 mol/L）的硫酸銨，在磁力攪拌器上勻速攪拌15min后離心（4℃，8000r/min，10min）取上清。再在上清中加入硫酸銨至濃度為B（1.8～2.6mol/L），勻速攪拌15min后離心取沉淀。沉淀用磷酸鹽緩沖溶液溶解待用。

（3）羥基磷灰石柱層析。樣品先用0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液透析過夜。上樣后用100、200mmol/L含0.1mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液梯度洗脫，流速6mL/min。將APC純度大于3部分的洗脫液合并透析過夜后再進行一次柱層析。

（4）APC得率和純度測定方法[10]。APC濃度=(A650-0.19×A620)/5.65；APC純度=A650/A280；純化系數=A650/A620。式中：A620、A650分別代表藻藍蛋白溶液在620、650 nm處的吸光度。

2 結果與分析

2.1 硫酸銨分級粗提純條件的優化

一步鹽析濃度選擇1.2、1.4、1.6、1.8mol/L和2.0mol/L，共5組，進行單因素實驗結果如圖1。由于一步鹽析在1.2～2.0 mol/L濃度下的純度差別不大，故采用純化系數和回收率作為篩選條件。由圖1可知，隨著一步鹽析濃度的增加，回收率不斷降低，純化系數先降低后不斷上升。一步鹽析在1.6 mol/L時APC對PC的含量比發生較大轉變，說明溶液中APC對PC的所占比例要高，故選取1.6 mol/L為一步鹽析最佳投加點。

二步鹽析濃度選擇1.8、2.0、2.2、2.4mol/L和2.6mol/L，共5組，進行單因素實驗結果如圖2。隨著硫酸銨濃度的增加純度先升后降，回收率不斷上升。二步鹽析在2.2 mol/L后APC純度發生陡降，而回收率趨勢平緩，故選取2.2 mol/L作為二步鹽析最佳濃度。

圖1 不同一步鹽析濃度下APC的純化系數和回收率

圖2 不同二步鹽析濃度下APC的純度和回收率

2.2 羥基磷灰石柱層析分離

圖3為第二次羥基磷灰石柱層析分級梯度洗脫曲線。由圖可知，洗脫峰為目標組分APC，穿過組分為少量藻藍蛋白和其他雜蛋白[11]。純化后的APC純度達到4.64，回收率高達11.25%。

圖3 二步羥基磷灰石柱層析分級梯度洗脫曲線

2.3 不同工藝階段純化結果比較

綜合四步工藝觀察APC純化過程變化的具體情況見表1。如表1所示，經四步工藝后，APC的純度由初始的0.32上升至4.64，達到試劑級的要求。

表1 不同階段APC的相關指標

2.4 光譜分析

對不同純化工藝階段后的組分進行200～700 nm全波長掃描，得到完整的光譜掃描圖如圖4。

因蛋白質中的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使得蛋白質具有紫外吸收的性質，其吸收峰約在280nm處[12]，但一步鹽析后的上清液中含有大量的核酸類物質，而核酸物質的最大吸收峰在260nm處[13]，因此該段吸收峰藍移至265nm。

圖4 不同階段的溶液紫外-可見吸收光譜圖

綜合四步純化工藝光譜圖看，APC溶液在250～300nm吸收譜帶中，吸收峰逐步從258 nm移至280nm。在500～700nm處吸收譜帶中，吸收峰逐步從620nm移至652nm，最終顯示出APC的典型吸收峰特性。

3 結論

運用兩步鹽析粗提純結合兩次羥基磷灰石層析的工藝能高效純化APC。實驗結果表明采用1.6、2.2mol/L硫酸銨分級粗提純效果最佳，兩步鹽析后純度由0.34上升到1.24。兩次羥基磷灰石過柱后純度達到4.64，回收率高達11.25%。采用同一種填料兩次過柱，無需更換填料和洗脫條件，減少填料成本，操作簡單，高效省時。

運用紫外-可見吸收光譜法分析各階段目標產物，可清晰反映目標APC的純化過程及去除雜質情況。分離出的APC在分別在277nm和652nm有兩個明顯吸收峰，顯示出APC的典型吸收峰特性。

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