NaCl脅迫下殼寡糖對(duì)油菜苗生長(zhǎng)的影響

丁振中，曾哲靈，龔勁松，張超，雷鵬，高小燕，徐俊山，張家宏

（1.揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司，江蘇揚(yáng)州225601；2.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225001）

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，土壤鹽漬化是影響農(nóng)作物生長(zhǎng)并造成作物產(chǎn)量降低最常見(jiàn)的非生物脅迫。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界鹽漬化土地的面積已超過(guò)10億公頃，而我國(guó)鹽漬化土地超過(guò)1億公頃[1]。土壤的鹽漬化會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的農(nóng)作物減產(chǎn)甚至絕收，因此，提高作物抗鹽的能力是保證我國(guó)糧食產(chǎn)量穩(wěn)定，促進(jìn)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要研究方向。

近年來(lái)，生物刺激素受到越來(lái)越多的關(guān)注。歐洲生物刺激素行業(yè)委員會(huì)提出，生物刺激素用于植物或植物根際后，能通過(guò)激發(fā)植物自身的生命過(guò)程來(lái)增強(qiáng)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及利用效率或提高植物的抗非生物脅迫能力或改善作物品質(zhì)，生物刺激素可以是化學(xué)物質(zhì)或微生物。目前，已有一些生物聚合物被歐洲生物刺激素行業(yè)委員會(huì)認(rèn)可作為生物刺激素，主要有腐植酸、幾丁質(zhì)、殼寡糖等[2]。然而，國(guó)內(nèi)針對(duì)殼寡糖在作物抗鹽方面的相關(guān)研究還比較少，基于此，本研究以油菜苗為對(duì)象，考察殼寡糖對(duì)油菜苗的抗鹽效果影響，并對(duì)其增強(qiáng)油菜苗的抗鹽機(jī)制進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長(zhǎng)條件

以甘藍(lán)型油菜蘇油1號(hào)（油菜種子采購(gòu)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）作為研究對(duì)象，種子消毒后置于濕潤(rùn)的濾紙上進(jìn)行催芽，約3天后，將露白的種子播種于營(yíng)養(yǎng)土中。油菜苗生長(zhǎng)環(huán)境為本課題組的光照培養(yǎng)室，控制光照時(shí)間為16 h，光培養(yǎng)溫度控制為25℃，暗培養(yǎng)溫度15℃，控制培養(yǎng)室濕度為65%。待油菜苗生長(zhǎng)4周后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的油菜苗轉(zhuǎn)入水培盒（34 cm×23 cm×10 cm）進(jìn)行水培培養(yǎng)。水培時(shí)使用1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。水培一周，待油菜苗適應(yīng)水培環(huán)境后，開(kāi)始施加實(shí)驗(yàn)處理。

1.2 脅迫實(shí)驗(yàn)處理

待油菜苗適應(yīng)水培環(huán)境后，設(shè)計(jì)4組處理，見(jiàn)表1。各處理組的油菜苗除在培養(yǎng)液中NaCl及殼寡糖的添加量不同外，其他培養(yǎng)條件均相同。營(yíng)養(yǎng)液每隔24 h按表中的處理更換一次，油菜苗施加處理后分別于第48 h、96 h、144 h取樣進(jìn)行各項(xiàng)生長(zhǎng)及生理指標(biāo)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)所有處理均設(shè)計(jì)3次重復(fù)。本研究中所用殼寡糖（COS）純品由揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司提供，分子量為2 kDa 。

表1 鹽脅迫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 生物量測(cè)定

測(cè)定油菜苗生物量時(shí)，每個(gè)處理每次取樣量均不少于6株苗，用吸水紙將油菜苗根部的營(yíng)養(yǎng)液吸干，用剪刀將油菜苗分為地上部分和地下部分，然后置于105℃烘箱中殺青30 min，隨后將烘箱溫度調(diào)至80℃烘干24 h，分別稱取油菜苗地上部分和地下部分的干重。

1.4 油菜苗葉片中K+/Na+值測(cè)定

K+/Na+值的測(cè)定參考Gorham的方法[3]。稱取1.00 g葉片組織，加入5 mL去離子水研磨成勻漿，5000 g離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，定容后用火焰分光光度計(jì)測(cè)定K+、Na+濃度。

1.5 丙二醛（MDA）含量測(cè)定

MDA含量的測(cè)定參考Liu等人的方法[4]。稱取0.5 g葉片組織，用5%（w/v）的三氯乙酸溶液研磨成勻漿；勻漿液在12000 g條件下離心15 min，上清液與5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液（用20%的三氯乙酸溶液配制）混合；混合液置于沸水中加熱25 min，冷卻至室溫后，7500 g離心5 min。離心后測(cè)定上清液在450 nm、532 nm、600 nm波長(zhǎng)下的吸光值。按照公式（1）計(jì)算葉片組織中MDA含量：

其中，C代表待測(cè)液中MDA濃度，A450、A532、A600分別代表待測(cè)液在在450 nm、532 nm、600 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

1.6 脯氨酸含量測(cè)定

脯氨酸含量的測(cè)定參考Bates的方法[5]。稱取葉片組織0.5 g，剪成碎片置于試管內(nèi)；向試管加入5 mL 3%磺基水楊酸，將試管置于沸水中浸提10 min；于試管內(nèi)取2 mL上清液，與2 mL乙酸、3 mL 2.5%酸性茚三酮顯色液混合后，沸水浴中加熱40 min；再向上述混合反應(yīng)液中加入4 mL甲苯，充分震蕩后靜置40 min；用移液器吸取上層甲苯層，在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。根據(jù)脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品在520 nm波長(zhǎng)下吸光值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出葉片組織中萃取的脯氨酸濃度。

1.7 抗氧化酶活力的測(cè)定

粗酶液的提取參考Abedi等的方法[6]。稱取0.5 g葉片組織，在1.5 mL Tris-HCl緩沖液（pH 7.5，含5%的蔗糖和0.1%的巰基乙醇）中研磨成勻漿；4℃下離心20 min；上清液即為粗酶液，用于測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）、過(guò)氧化氫酶（CAT，EC 1.11.1.6）和過(guò)氧化物酶（POD，EC 1.11.1.7）的活力。粗酶液蛋白含量按照Bradford的方法，即考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定。

SOD活力的測(cè)定參考Abedi等的方法[6]。吸取0.1 mL上述粗酶液，與1.5 mL50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8，內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）、0.3 mL130 mmol/L甲硫氨酸溶液（用磷酸緩沖液配制）、0.3 mL750 μmol/L氮藍(lán)四唑溶液（用磷酸緩沖液配制）、0.3 mL100 μmol/L EDTA-Na2溶液（用磷酸緩沖液配制）、0.3 mL20 μmol/L核黃素溶液（用磷酸緩沖液配制）及0.5 mL去離子水混合，將混合溶液置于4000 lx日光燈下反應(yīng)20 min，反應(yīng)液為樣品組；以0.1 mL磷酸緩沖液替代上述混合液中的粗酶液，在4000 lx日光燈下反應(yīng)20 min，反應(yīng)液作為對(duì)照組；以0.1 mL磷酸緩沖液替代上述混合液中的粗酶液，在黑暗條件下反應(yīng)20 min，反應(yīng)液作為空白組；測(cè)定各組反應(yīng)液在560 nm波長(zhǎng)下的吸光值。SOD酶活定義為抑制50%氮藍(lán)四唑還原所需要的酶量，SOD酶活表示為U/mgprotein。

CAT活力的測(cè)定參考Abedi等的方法[6]。用移液器分別將0.1 mL 2% H2O2和2 mL50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0，含1%聚乙烯吡咯烷酮、0.1%巰基乙醇）加入1 cm比色皿中，再加入0.1 mL粗酶液，常溫下混勻，立即在240 nm波長(zhǎng)下5 min內(nèi)測(cè)定吸光值，每隔1 min讀一次數(shù)，直至每分鐘的吸光值降低量達(dá)到穩(wěn)定。CAT的活力定義為每分鐘H2O2的減少量，表示為mmol/(min·g) protein。

POD活力的測(cè)定參考Zhou和Leul的方法[7]。吸取0.1 mL粗酶液，與2.9 mL50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0，含1%聚乙烯吡咯烷酮、0.1%巰基乙醇）、0.5 mL 2%H2O2溶液、0.1 mL 2%愈創(chuàng)木酚溶液混合；混合液直接在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，每隔1 min記錄一次，共記錄5次。POD活力定義為每分鐘愈創(chuàng)木酚的氧化量，表示為nmol/(min·mg) protein。

2 結(jié)果與討論

2.1 NaCl脅迫下殼寡糖對(duì)油菜苗生物量的影響

NaCl脅迫下殼寡糖對(duì)油菜苗生物量影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。如表2所示，在非脅迫條件下殼寡糖能促進(jìn)油菜苗的生長(zhǎng)。處理144 h后，與CK組相比，NaCl脅迫顯著抑制了油菜苗的生長(zhǎng)，但在添加了殼寡糖的條件下（NaCl+COS組），油菜苗全植株、地上部分以及地下部分的干重比NaCl組分別顯著提高了37.4%、38.8%和34.1%。結(jié)果表明，殼寡糖緩解了鹽脅迫對(duì)油菜苗生長(zhǎng)的抑制。一般來(lái)說(shuō)，在高鹽環(huán)境中，植物生物量的提高與其所處的生理環(huán)境有關(guān)，生物量的增加意味著植物體內(nèi)的離子分布更合理，所受的活性氧（ROS）毒害更少，其自身滲透調(diào)節(jié)能力更強(qiáng)[8]。因此，殼寡糖能緩解鹽脅迫導(dǎo)致的生物量降低，說(shuō)明其對(duì)油菜苗的離子平衡、滲透調(diào)節(jié)、ROS清除等生理過(guò)程產(chǎn)生了影響。

2.2 殼寡糖對(duì)K+/Na+值的影響

在鹽脅迫條件下，細(xì)胞內(nèi)的K+/Na+值通常能夠反映植物受到的鹽傷害程度。受到NaCl脅迫時(shí)，環(huán)境中的Na+會(huì)取代K+轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而降低細(xì)胞內(nèi)的K+/Na+值，過(guò)量的Na+在細(xì)胞內(nèi)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害[9]。NaCl脅迫下殼寡糖對(duì)油菜苗葉片中K+/Na+值的影響如圖1所示。在非脅迫條件下，殼寡糖處理（COS組）能顯著提高油菜苗葉片內(nèi)的K+/Na+值，特別是在施加處理96 h后。在NaCl脅迫下，油菜苗葉細(xì)胞內(nèi)的K+/Na+值顯著地降低，特別是在處理后144 h，NaCl組中的K+/Na+值與CK組中的K+/Na+值相比下降了97.1%。然而，在取樣時(shí)間內(nèi)，殼寡糖的施用（NaCl+COS組）則在一定程度上緩解了NaCl引起的K+/Na+值的降低。在144 h時(shí)，NaCl+COS組中油菜苗葉片內(nèi)的K+/Na+值是NaCl組的8倍。以上結(jié)果表明，鹽脅迫環(huán)境下，殼寡糖能在一定程度上緩解NaCl引起的K+/Na+值的降低。

圖1 NaCl脅迫下殼寡糖對(duì)油菜苗葉片中K+/Na+值的影響

表2 NaCl脅迫下殼寡糖對(duì)油菜苗全植株、地上部分和地下部分干重的影響

2.3 NaCl脅迫下殼寡糖對(duì)MDA含量的影響

高鹽脅迫還會(huì)引起ROS在植物細(xì)胞內(nèi)大量積累，從而進(jìn)一步造成對(duì)細(xì)胞的氧化脅迫，由過(guò)剩ROS引起的膜脂氧化一般被認(rèn)為是高鹽脅迫對(duì)細(xì)胞的主要傷害。MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，通常細(xì)胞內(nèi)的MDA濃度能直接反映ROS對(duì)植物細(xì)胞的傷害程度[10]。殼寡糖對(duì)MDA含量的影響如圖2所示。與CK組相比，COS組中油菜苗葉片內(nèi)的MDA含量無(wú)顯著變化。但在NaCl脅迫條件下，油菜苗葉片內(nèi)的MDA含量顯著提高。盡管NaCl組與NaCl+COS組中油菜苗葉片內(nèi)的MDA含量均顯著高于CK組，但在取樣時(shí)間內(nèi)，NaCl+COS組中MDA含量始終顯著低于NaCl組。在144 h時(shí)，與NaCl組相比，NaCl+COS組中MDA含量減少了16.7%。以上結(jié)果表明，鹽脅迫引起了油菜苗葉片中MDA含量的增加，而殼寡糖可以顯著緩解鹽脅迫導(dǎo)致的MDA含量提高，這說(shuō)明，殼寡糖對(duì)鹽脅迫環(huán)境下ROS的清除起著積極的作用。

圖2 NaCl脅迫下殼寡糖對(duì)油菜苗葉片中MDA含量的影響

2.4 殼寡糖對(duì)抗氧化酶活力的影響

本研究考察了殼寡糖對(duì)SOD、CAT、POD3種抗氧化酶活力的影響。這3種酶是植物體內(nèi)清除過(guò)剩ROS的主要酶系，植物在受到鹽脅迫后能夠通過(guò)增強(qiáng)這3種抗氧化酶來(lái)緩解鹽脅迫引起的氧化脅迫[11]。殼寡糖對(duì)抗氧化酶的影響如圖3所示。在本研究中，SOD、CAT、POD具有相似的變化趨勢(shì)，在非脅迫環(huán)境下，3種抗氧化酶受COS影響（COS組），其活力均呈現(xiàn)出上調(diào)的趨勢(shì)。在NaCl脅迫環(huán)境下（NaCl組），3種酶的活力顯著提高，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，在144 h時(shí)，酶活呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)；而在使用殼寡糖后（NaCl+COS組），3種酶的酶活不僅在取樣時(shí)間內(nèi)顯著高于NaCl組，而且在取樣時(shí)間內(nèi)，始終呈現(xiàn)高活力狀態(tài)。因此，殼寡糖有助提高油菜苗葉片內(nèi)的SOD、CAT、POD活力，并且在NaCl脅迫環(huán)境下這種增強(qiáng)效果更為顯著。因此，NaCl脅迫環(huán)境下，殼寡糖能顯著提高油菜苗葉片中3種抗氧化酶的活力，這說(shuō)明在高鹽脅迫環(huán)境中殼寡糖增強(qiáng)了油菜苗清除過(guò)剩ROS的能力，從而降低了膜脂的氧化程度，減少了胞內(nèi)MDA的產(chǎn)生。

圖3 NaCl脅迫下殼寡糖對(duì)油菜苗葉片中SOD（A）、CAT（B）和POD（C）活力的影響

2.5 殼寡糖對(duì)脯氨酸積累的影響

在高鹽環(huán)境中，植物還會(huì)通過(guò)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫引發(fā)的胞內(nèi)外滲透壓失衡，對(duì)于大部分植物，通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)積累脯氨酸等小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是應(yīng)對(duì)滲透壓失衡的主要策略[12]。殼寡糖對(duì)脯氨酸的積累如圖4所示。與CK組相比，COS組中油菜苗葉片內(nèi)的脯氨酸含量呈明顯上升趨勢(shì)，特別是在施加處理96 h之后。在鹽脅迫環(huán)境中，油菜苗葉片內(nèi)的脯氨酸含量顯著提高，并且NaCl+COS組中脯氨酸含量顯著高于NaCl組，特別是在施加處理96 h后。在144 h時(shí)，NaCl+COS組中油菜苗葉片內(nèi)的脯氨酸含量達(dá)到3.505 mg/g FW，比NaCl組高出36.5%。結(jié)果表明，無(wú)論是否在鹽脅迫環(huán)境下，殼寡糖均能促進(jìn)油菜苗葉片內(nèi)脯氨酸的積累，但在鹽脅迫環(huán)境中，殼寡糖使脯氨酸的積累更為顯著。

圖4 NaCl脅迫下殼寡糖對(duì)油菜苗葉片中脯氨酸（proline）含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，殼寡糖即使在非脅迫條件下也能促進(jìn)油菜苗脯氨酸的積累，而脯氨酸除了是一種小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還能作為信號(hào)分子來(lái)調(diào)控離子平衡、穩(wěn)定細(xì)胞酶活，以及啟動(dòng)特定基因的表達(dá)，這對(duì)植物應(yīng)對(duì)高鹽環(huán)境都至關(guān)重要[13]。Khedr等人發(fā)現(xiàn)，脯氨酸能夠誘導(dǎo)鹽脅迫相應(yīng)蛋白的表達(dá)[14]；Sobahan等人發(fā)現(xiàn)外源施用脯氨酸能夠有效抑制鹽脅迫環(huán)境中植物對(duì)Na+的吸收，增強(qiáng)植物對(duì)K+的吸收，提高細(xì)胞內(nèi)的K+/Na+值[15]；Yan等人報(bào)道外源施用脯氨酸還能提高SOD、CAT、POD等抗氧化酶的活力，從而降低脅迫環(huán)境中植物細(xì)胞內(nèi)的ROS水平[16]。因此，筆者推測(cè)，殼寡糖能夠緩解油菜苗遭受NaCl脅迫時(shí)的Na+毒害以及氧化傷害，與其促進(jìn)油菜苗細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸積累有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究以水培油菜為研究對(duì)象，考察鹽脅迫條件下殼寡糖對(duì)油菜生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，NaCl顯著抑制油菜苗生長(zhǎng)，但施用了殼寡糖后，油菜苗的全植株干重、地上部分干重、地下部分干重分別提高了37.4%、38.8%和34.1%，說(shuō)明殼寡糖確實(shí)能緩解鹽脅迫對(duì)植物的傷害。研究還發(fā)現(xiàn)，100 mmol/LNaCl脅迫環(huán)境下，殼寡糖在一定程度上抑制了油菜苗細(xì)胞內(nèi)K+/Na+值的降低和丙二醛（MDA）含量的增加；此外，殼寡糖增加了脯氨酸的積累，增強(qiáng)了抗氧化酶（SOD、CAT、POD）的活力。上述結(jié)果說(shuō)明殼寡糖提高了油菜苗在鹽脅迫下的滲透調(diào)節(jié)能力和ROS清除能力。考慮到殼寡糖在非脅迫條件下也能促進(jìn)脯氨酸積累，本研究認(rèn)為，殼寡糖激活了脯氨酸的合成途徑，提高了油菜苗細(xì)胞內(nèi)脯氨酸的積累量，從而增強(qiáng)了油菜苗鹽脅迫下的耐受能力。

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