枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶基因的克隆與表達

單妍，王毅，吳麗君，馬永凱，宋鵬飛，魏云林

（1.昆明醫(yī)科大學海源學院，云南昆明 650106；2.云南中煙工業(yè)有限責任公司，云南昆明 653100；3.昆明理工大學生物工程技術研究中心，云南昆明 650500）

烤煙葉片在大田生育過程中會有一定的淀粉積累，淀粉含量越高，反映煙葉越成熟。但在煙葉經(jīng)過陳化后，烤煙葉片內(nèi)大量的淀粉、纖維素、果膠質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)將對煙葉成色質(zhì)量、煙絲成形質(zhì)量、卷煙吸食品質(zhì)具有較大的負面影響[1]。因此，降低陳化煙葉中的淀粉含量，勢必成為提高煙葉品質(zhì)的關鍵因素。據(jù)報道，施加淀粉酶處理煙葉可使淀粉含量明顯降低[2-4]。李曉等[5]應用混合酶制劑（糖化酶和α-淀粉酶）水解淀粉，淀粉轉(zhuǎn)化成還原糖增加了20%左右，能有效降解原煙中大部分的淀粉，煙葉品質(zhì)得到了有效改善。因此，利用淀粉酶降解淀粉對于提高卷煙燃燒的完全性和燃吸時的氣味有積極的作用。雖然已有報道開發(fā)出了能用于加速煙葉陳化的單一和復合酶制劑，并初步在工業(yè)上得到了驗證，但依然存在酶性質(zhì)不清、產(chǎn)量偏低、生產(chǎn)中許多因素不可控、生產(chǎn)成本較高等問題，同時由于原始菌株的長期使用從而導致品種的嚴重退化，給規(guī)模化生產(chǎn)帶來重重困難。為了徹底解決煙葉陳化用酶產(chǎn)率低，品質(zhì)不穩(wěn)定等技術難關，本課題篩選到陳化煙葉中的一株產(chǎn)淀粉酶菌株，鑒定結(jié)果為枯草芽孢桿菌，在此基礎上對其進行克隆與表達，達到利用淀粉酶高效降解淀粉以提高煙葉品質(zhì)的目的，同時為指導煙草用酶制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 菌種與質(zhì)粒

受體菌大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)和質(zhì)粒pET30α都為本實驗室保存。

1.2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶、ExTaq DNA聚合酶和質(zhì)粒提取試劑盒購自TaKaRa生物工程有限公司，T4DNA連接酶，質(zhì)粒提取、凝膠回收試劑盒及Ni-NTA購自上海生工生物工程公司，其余選用的實驗試劑為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 淀粉酶YX48-1菌株的篩選與鑒定

選取陳化煙葉樣品并進行稀釋涂布，初步篩選到6株產(chǎn)淀粉酶菌株。以此為基礎，通過測定酶活在液體培養(yǎng)中復篩出1株高產(chǎn)淀粉酶的優(yōu)質(zhì)菌株，命名為AmyYX48-1。提取基因組DNA擴增其16S rRNA片段，擴增片段后測序參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[6]再進行同源比對，可判斷待測菌的種屬類別[7]。

2.2 YX48-1的全基因組測序及淀粉酶基因分析

根據(jù)文獻公布淀粉酶基因保守序列比對后，設計合成上下游引物，上游：5'- CGGGATCCATGTTTGCAAAACGATTCAAAA-3' ；下游：5'-CCCAAGCTTATGAGG AAGAGAACCGCTTA-3'。其中劃線部分即為加入的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位點。再以高產(chǎn)淀粉酶菌株總DNA為模板，用ExTaq DNA聚合酶進行PCR擴增。擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸90s，循環(huán)30次；72℃補充延伸10 min。擴增產(chǎn)物連接到T載體上，將樣品通過Hiseq2000測序平臺送華大基因公司進行測序分析。

2.3 煙用產(chǎn)淀粉酶基因的克隆、表達及純化

2.3.1 煙用重組淀粉酶的質(zhì)粒構建

將擴增得到的目的片段連接已經(jīng)過雙酶切的表達載體pET-30a，得到重組質(zhì)粒pET。將重組質(zhì)粒pET轉(zhuǎn)入表達宿主E.coli BL21(DE3）中，經(jīng)Kan抗性篩選、菌落PCR篩選得到克隆菌株E.coli BL21-pET。

2.3.2 重組淀粉酶的誘導表達及純化

把重組載體pETamyYX48-1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E .coli BL21感受態(tài)細胞中進行表達。將轉(zhuǎn)化子于37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中后期，其OD值約為1.0。加入終濃度為1mmol/L的IPTG，16℃、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)12h。把培養(yǎng)好的發(fā)酵液高速離心收集菌體，利用破胞緩沖液洗滌菌體；重懸后在冰浴條件下超聲波破胞。當菌液澄清時離心收集上清，對上清液金屬鎳親和層析法進行純化。利用SDS-PAGE凝膠電泳來檢測純化效果及酶活性定性。

2.3.3 淀粉酶活性

將0.5mLpH6.8緩沖液配制的1%可溶性淀粉溶液作為底物，在37℃預熱2min后加入稀釋的酶液50μL，于37℃反應5 min，然后加入350μL的DNS[8]煮沸5min終止其反應。設定波長540nm處測OD值來計算產(chǎn)生的還原糖量。本法規(guī)定淀粉酶活力單位（U）：在37℃ pH6.8條件下，每分鐘生成1μmol葡萄糖所需的酶量為一個酶活單位（1U）。

3 結(jié)果與分析

3.1 淀粉酶YX48-1菌株的篩選與鑒定

根據(jù)菌落的形態(tài)與培養(yǎng)特征、生理與生化、提取基因組DNA擴增其16SrRNA后鑒定結(jié)果在進行同源序列比對，發(fā)現(xiàn)其與Bacillus subtilis同源性達到95%，故初步鑒定為枯草芽孢桿菌。

3.2 煙用重組淀粉酶的質(zhì)粒構建

通過引物的設計，以篩選得到的產(chǎn)淀粉酶菌株總DNA為模版進行克隆，凝膠電泳結(jié)果（圖1）所示，所得淀粉酶基因大小約為2000bp。雙酶切結(jié)果（圖2）都證明該基因已經(jīng)克隆到質(zhì)粒pET30α中（圖3），后測序結(jié)果顯示編碼區(qū)全長1998bp，編碼665個氨基酸，理論蛋白質(zhì)分子量為73.12kD。

圖1 淀粉酶基因片段PCR產(chǎn)物

圖2 淀粉酶表達載體單雙酶切電泳驗證圖

圖3 PCR檢測淀粉酶重組質(zhì)粒

3.3 重組載體在大腸桿菌中的表達與純化

重組載體pET48-1在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中表達、純化后，經(jīng)SDS-PAGE驗證分析，在分子量約為72kD處有明顯的特異條帶，如圖4所示。

圖4 SDS-PAGE電泳檢測淀粉酶的表達

圖5 蛋白純化效果示意圖

3.4 重組淀粉酶活性

經(jīng)初步測定，采用DNS試劑法進行測定，通過對葡萄糖繪制吸光度-濃度曲線，37℃，pH7.0測定表達后結(jié)果顯示重組蛋白量較高，淀粉酶活力約為1700U/mL，相比于初始菌株酶活力擴大10倍以上。

4 結(jié)論

根據(jù)文獻報道，枯草芽孢桿菌可從產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)淀粉酶微生物中發(fā)現(xiàn)[9]，本課題中結(jié)果也以此一致，本研究從烤煙葉片中取樣篩選鑒定出高產(chǎn)淀粉酶的菌株，以產(chǎn)淀粉酶菌株的基因組DNA為模板進行基因克隆及異源高效表達，解決了酶產(chǎn)量偏低、酶活性不高等問題，將為以后規(guī)模化、工業(yè)化生產(chǎn)高品質(zhì)煙葉奠定堅實的基礎。

據(jù)研究，利用酶法降解烤煙內(nèi)淀粉含量的方法中，所采用的酶大多為外源酶[10]。本研究結(jié)果從煙葉本身能得到重組淀粉酶高效表達，隨之降解煙葉中淀粉，其優(yōu)越性在于淀粉來源于煙葉本身，這樣不但改善了煙葉的品質(zhì)，人們吸食的安全性也得到足夠的保障。后續(xù)，將針對所篩選的產(chǎn)淀粉酶微生物進行發(fā)酵條件優(yōu)化、深入重組淀粉酶酶學性質(zhì)研究等工作，將來為淀粉酶規(guī)模化、工業(yè)化應用于提高煙草制品的品質(zhì)提供了有力依據(jù)。

[1]王懷珠,楊煥文,郭紅英.烘烤過程中不同成熟度煙葉淀粉的降解動態(tài)[J].煙草科技,2004,10(5):36.

[2]姚光明,閻克玉,李曉,等.烤煙中殘留淀粉的酶降解研究[J].鄭州輕工業(yè)學院學報(自然科學版),2000,15(3):25-27.

[3]李曉,劉風珠,姜凌,等.淀粉類酶在煙葉中降解條件的研究[J].生物技術,2001,11(2):44-46.

[4]王懷珠,楊煥文,郭紅英.烘烤過程中外加淀粉類酶對烤煙淀粉降解的影響[J].生物技術,2004,14(5):67-69.

[5]李曉,劉風珠,姜凌,等.淀粉類酶在烤煙中降解條件的研究[J].生物技術,2001,11(12):44-46.

[6]布坎R.E.,吉本斯NE.伯杰氏細菌鑒定手冊[M].8版.北京:科學出版社,1984

[7]潘濤.一株酸α-淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選,發(fā)酵條件及基因克隆研究[D].鄭州:河南工業(yè)大學,2010.

[8]Nanmori T, Nagai M, Shimizu Y, et al. Cloning of the Beta-amylase Gene from Bacillus Cereus and Characteristic of the Primary Structure of the Enzyme[J].Applied and Environmental Microbiolo gy,1993,59(2):623-627.

[9]姚光明.降低煙葉中蛋白質(zhì)含量的研究[J].煙草科技,2000,148(9):6-8.

[10]樊文舉,高娟娟,張建新.外源酶制劑對烤煙煙葉化學品質(zhì)的影響[J].福建農(nóng)業(yè)學報,2017,32(6):652-659.