氣相色譜法測定食品中乙酰丙酸的方法驗證

朱燕萍

選取市售醬油、飲料、餅干及奶粉樣品，優化GB5009.252- 2016的前處理流程，改分液漏斗提取為離心管提取模式，改無水硫酸鈉除水為濾頭過濾，利用GC- FID，從專屬性、線性、范圍、準確度、精密度、檢測限、定量限七個方面對食品中乙酰丙酸的測定進行方法驗證。結果表明，線性范圍在12.5mg/L- 750mg/L時，乙酰丙酸的線性相關系數r2 在0.9998- 0.9999之間，基質加標回收率在91.68% - 104.42%之間，相對標準偏差為0.12%- 5.64%。方法檢出限為4.9 mg/kg，定量限為16.4 mg/kg，滿足國標GB5009.252-2016的要求。

乙酰丙酸（果糖酸）是酸水解植物蛋白調味液中存在的一種特殊的有機酸成分，一般而言，純釀造醬油中，乙酰丙酸的含量極微（<0.01%）。因而，測定乙酰丙酸的含量，可以判斷是釀造醬油還是氨基酸液配制醬油。然而隨著生活質量的日益提高，人們對于食品安全的關注度日益提高。GB2760- 2014《食品添加劑使用標準》中也提到了乙酰丙酸，但并未對添加的量有一個具體的指標。GB5009.252- 2016對乙酰丙酸的測定基質范圍由之前的醬油擴展為食品，其中第一法提出了使用內標法測定食品中的乙酰丙酸。實際操作中，前處理方法沿襲GB5009.121- 2003（已廢棄）脫氫乙酸的萃取模式，使用分液漏斗振搖萃取，并且比色管靜置的方式對于易乳化的樣品，需要較多的時間，無法應對大批量的樣品檢測。同時2次水洗的過程對乙酰丙酸的回收率影響較大。為了優化實驗過程，縮短前處理時間，提高乙酰丙酸的回收率，對食品中乙酰丙酸的前處理過程加以改進。將樣品稱于50ml離心管中，更改分液漏斗萃取為離心管直接提取，更改無水硫酸鈉脫水為濾頭過濾。GB/ T27025- 2008中指出，實驗室應對非標準方法、實驗室設計（制定）的方法、超出其預定范圍使用的標準方法、擴充和修改過的方法進行確認，以證實該方法適用于預期的用途。故在引用GB5009.252- 2016的基礎上，本實驗驗證調整前處理過程后確保實現正常進行的可行性。

材料與儀器

1.GC- FID氣相色譜：Agilent 7890A

2.乙酰丙酸準品：Sigma- Aldrich

3.正庚酸標準品：百靈威

4.樣品：市售

5.濃HCL：默克

6.乙醚（分析純）：凌峰

7.乙酸乙酯（色譜純）：DikmaPure

標準儲備液的配制

1.正庚酸內標標準儲備溶液（5000mg/ L）：稱取0.5g正庚酸（精確至0.00001），用乙酸乙酯定容至100ml容量瓶，混勻。

2.乙酰丙酸標準儲備溶液（5000mg/L）：稱取0.5g乙酰丙酸（精確至0.00001），用乙酸乙酯定容至100ml容量瓶，混勻。

儀器參數

1.參數

色譜柱：D B - W A X毛細管柱 （ 3 0 m×0.25mm×0.25μm）

柱溫：120℃，保持1min，以8℃/min程序升溫至230℃，保持4min

進樣口和檢測器溫度：270℃

載氣：高純氮，純度99.999%，流速：1.0mL/min

氫氣流速：30mL/min

空氣流速：300mL/min

尾吹氣流速：30mL/min

進樣方式：分流進樣，分流比：25：1

進樣體積：1ml

2.乙酰丙酸標準溶液色譜圖

分項綜述

1.專屬性

專屬性是指明確地測定出目標化合物的能力，考慮不純，降解和基質影響等因素。測試項目及觀察值，見表1。

3.準確度及精密度

選取4種不同基質樣品中，分別進行低，中，高濃度水平的加標，每個濃度試驗三次，評估回收率及相對標準偏差（RSD）。

（1）前處理過程：

稱取5.00g事先均勻化的樣品于50mL離心管，加入1.0mL正庚酸標準儲備液，并對樣品進行加標，樣品中加標濃度水平分別是25mg/ kg，500mg/kg，1500mg/kg。加入10mL飽和NaCl溶液， 3.0mL濃鹽酸。充分渦旋1min后，加入25ml乙醚，渦旋3- 5min，離心分離5min。吸取上層有機相于150mL平底燒瓶，再重復萃取兩次，合并乙醚萃取液。45℃左右旋蒸至干，用乙酸乙酯定容至10ml，過濾上機。

（2）所得數據如下，計算樣品中乙酰丙酸回收率。

（3）小結

從試驗數據得知，回收率最低的是91.68%，相對標準偏差最低的是5.64%。實際實驗過程中，醬油及奶粉易產生乳化現象，離心分離的過程減少了等待的時間，并且減少水洗和無水硫酸鈉吸附過程后回收率保持較好的水平。同樣的，不同基質的橫向比較，能查看到餅干及奶粉這種含油樣品，在旋蒸后含油量較高，峰型出現稍許拖尾，參考文獻固相萃取-氣相色譜聯用測定醬油中乙酰丙酸，可以考慮之后對含油量較高樣品進行除油的操作來降低油脂的影響。

4.檢測限和定量限

方法檢測限（MDL），MDL=3SD；定量限（LOQ），LOQ=10SD。

在不同基質樣品中，進行10次曲線最低點加標再現性試驗，評估3SD和10SD。

（1）加標溶液配制：

稱取10份混合均勻的不同基質樣品5克，并對其加標，加標濃度為25mg/kg，其余步驟同上。得到樣品加標理論濃度為25mg/kg。

（2）小結：

乙酰丙酸方法檢出限為：4.93mg/kg

乙酰丙酸定量限為：16.4 mg/kg

滿足GB5009.252- 2016第一法的要求：檢出限10mg/kg， 定量限25mg/kg。

用離心管代替分液漏斗萃取，改善靜置為離心的方式完成GB5009.252-2016方法的測試，滿足測試所需各項要求。在針對多批量樣品時，前處理條件的改善，不僅減少了時間和人力成本，也提高了實驗的回收率及效率，可以證明本實驗室具備食品中乙酰丙酸測試的能力。