硅膠固相萃取凈化/高效液相色譜-串聯質譜法測定海洋生物體中六溴環十二烷

嚴忠雍，張小軍，陳雪昌，方 益，張 帥，孫秀梅*

(1.浙江省海洋水產研究所,浙江 舟山 316021;2.浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江 舟山 316021)

圖1 3種六溴環十二烷的結構示意圖Fig.1 Chemical structures of HBCDs

六溴環十二烷( Hexabromocyclododecanes，HBCDs)屬脂環族溴系添加型阻燃劑，主要用于阻燃聚苯乙烯泡沫材料、紡織品、環氧樹脂、硅樹脂等。HBCDs由于缺乏化學鍵作用，易在產品的生產、使用、回收和最終處理過程中釋放出來，造成環境污染[1]。HBCDs作為高持久性、高生物蓄積性和毒性物質，主要有3對對映結構的異構體，分別為(±)α-HBCD(10%～13%)、(±)β-HBCD(1%～12%)、(±)γ-HBCD(75%～89%)[2]，結構式如圖1所示。HBCDs在環境中難降解，可以長期存在，并可通過水體、沉積物進入水生生物鏈中對生態環境及動物造成傷害，其對動物的大腦、肝臟、腎臟等器官以及內分泌、生殖發育系統和神經系統有毒性，因而受到各研究領域的廣泛關注[3-6]。2013年5月HBCDs被列入《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》禁用化學制品黑名單。2017年起中國將HBCDs增列至《中國嚴格限制進出口的有毒化學品目錄》，禁止HBCDs的生產、使用和進出口[7]。為科學評估HBCDs的危害，非常有必要建立海洋生物體中六溴環十二烷的檢測方法。

HBCD在環境樣品中的分析檢測屬于復雜基質中痕量組分的分析檢測，可采用氣相色譜(GC)或氣相色譜-質譜法(GC-MS)進行測定，但HBCD在160 ℃會發生3種異構體間的互相轉化，在240 ℃以上產生脫溴降解現象，進一步限制了GC法對HBCD 的測定。當前對HBCD 異構體的測定普遍采用高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)[8-14]，該方法的靈敏度高、選擇性和特異性好。出入境檢驗檢疫行業標準SN/T 3543-2013《出口食品中三種六溴環十二烷的測定 液相色譜-質譜/質譜法》[15]規定試樣中的六溴環十二烷經二氯甲烷索氏提取，提取液經凝膠色譜柱凈化，正己烷二氯甲烷洗脫，然后用液相色譜-串聯質譜法測定。該標準雖達到了HBCD的分析要求，但前處理步驟繁瑣耗時，且須配備儀器輔助凈化，不適合規模樣品檢測和方法技術推廣。本方法以固相萃取為凈化手段，通過高效液相色譜柱分離，用高效液相色譜-串聯質譜法測定海洋生物體中α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD含量，內標法進行定量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜-質譜儀Quattro Premier XE(配備電噴霧離子源，美國Waters公司);R210旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司)；MS3旋渦混合器(德國IKA公司)；超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation公司)；Centrifuge5810高速離心機(德國Eppendorf公司)；12通道固相萃取裝置(美國Supelco公司)；硅膠固相萃取柱(6 mL/1 000 mg，上海安譜實驗科技股份有限公司)。

HBCDs標準品及其同位素標記物(100 mg/L，美國Accustandard公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；正己烷、二氯甲烷(色譜純，美國J.T.Baker公司)；實驗用水為經Millipore系統處理的超純水。

六溴環十二烷混合標準使用液(100 μg/L)：移取適量六溴環十二烷混合標準溶液，用甲醇稀釋配成100 μg/L混合溶液，4 ℃冷藏保存，有效期1個月。

六溴環十二烷混合內標使用液(100 μg/L)：移取適量六溴環十二烷混合內標溶液，用甲醇逐級稀釋配成100 μg/L混合溶液，4 ℃冷藏保存，有效期1個月。

1.2 樣品前處理方法

稱取5.00 g(準確至0.01 g)均質后的待測樣品，置于50 mL離心管中，加入100 μL同位素內標標準使用液，再加入15 mL正己烷，渦旋振蕩1 min，超聲振蕩10 min后，6 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至旋轉蒸發瓶；殘渣用15 mL正己烷按上述方法再提取1次，所得上清液合并至旋轉蒸發瓶，在40 ℃水浴條件下旋轉蒸發濃縮至近干，加入5 mL正己烷溶解，超聲振蕩1 min備用。

移取提取液加至已用5 mL正己烷活化的硅膠固相萃取柱上，先用2 mL正己烷淋洗，再用5 mL二氯甲烷洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min，用15 mL離心管收集洗脫液，洗脫液于40 ℃氮氣吹干，用甲醇定容至1.0 mL，旋渦振蕩1 min，經0.22 μm有機相微孔濾膜過濾，待儀器分析。

1.3 色譜及質譜條件

色譜柱：ACQUITYTMUPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；進樣體積10 μL；樣品室溫度6 ℃；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；流動相：A為純水，B為甲醇乙腈溶液(4∶6，體積比);梯度洗脫：0～1.0 min，80%～25% A；1.0～8.0 min，25%～15%A;8.0～8.1 min，15%～80% A；8.1～10.0 min，80% A。

表1 六溴環十二烷的質譜參數Table 1 Mass parameters of HBCDs

*quantitative ion

電噴霧離子源，負離子掃描(Electrospray ionization，ESI-)；檢測方式：多反應監測模式(MRM)；毛細管電壓：3.5 kV；錐孔電壓：18 V；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：360 ℃；錐孔氣流量：100 L/h；脫溶劑氣流量：800 L/h；六溴環十二烷的母離子及子離子等質譜多反應監測條件如表1所示。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的優化

α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD 3種化合物屬于同分異構體，且監測的特征離子信息相同，無法實現質譜上的分離，所以在液相色譜上必須實現3種化合物的有效分離。選用ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)作為六溴環十二烷的色譜分離柱，選擇純水為水相，分別考察了甲醇、乙腈作為流動相的有機相時的分離效果。實驗結果表明，當使用甲醇作為有機相時，α-HBCD與β-HBCD、γ-HBCD能有效分離，但β-HBCD與γ-HBCD不能分離；當使用乙腈作為有機相時，γ-HBCD與α-HBCD、β-HBCD能有效分離，但α-HBCD與β-HBCD不能分離。即使調整甲醇、乙腈的梯度，也無法保證α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD的有效分離。而選擇甲醇-乙腈混合溶液(4∶6)為有機相，可使α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD在10 min內于液相色譜上得到有效分離，且分離度好，峰形尖銳。

2.2 質譜條件的確定

采用蠕動泵注射直接進樣方式對1 mg/L 的HBCD和13C-HBCD標準溶液進行質譜條件的優化，使用ESI源在正離子和負離子模式下進行全掃描以選擇適當的定性、定量離子和電離方式。結果表明：在ESI-模式下，HBCD呈現出最佳響應，特征離子[M-H]-是響應強度最高的離子，選作母離子。然后進行二級質譜分析，找出二級質譜中兩個信號較強的碎片離子，以信號最強的作定量離子，另一個作輔助定性離子，并對碰撞能量、錐孔電壓、毛細管電壓、離子源溫度、錐孔氣流量、脫溶劑氣流量等參數進行優化，得到最佳的質譜條件見表1。

2.3 提取條件的優化

分別采用丙酮、正己烷、甲醇、乙腈作為萃取劑提取樣品中六溴環十二烷，用加標回收率間接判斷試劑的提取效率。結果表明，丙酮的回收率為62%～73%，正己烷的回收率為89%～98%，甲醇的回收率為71%～78%，乙腈的回收率為86%～93%。數據表明正己烷提取六溴環十二烷時的回收率最高，提取效果最好，而乙腈雖有較高的回收率，但提取后易與水互溶，導致旋轉蒸發過慢，降低了實驗效率，最終選擇正己烷作為提取劑。

為進一步提高正己烷的提取效率，分別考察了正己烷提取1次、2次、3次、4次時對六溴環十二烷回收率的影響，結果顯示，3種六溴環十二烷的提取率相近，而且當提取次數超過2次后，六溴環十二烷的回收率趨于穩定，因此本實驗選用正己烷提取2次。

2.4 洗脫條件的選擇

硅膠固相萃取柱具較強的極性作用力，屬于正相萃取柱；通常根據洗脫溶劑的極性，選擇合適的洗脫強度。實驗分別采用環己烷、二氯甲烷、乙腈和甲醇(極性由弱到強)作為洗脫溶劑，通過比較不同溶劑的回收率、基質效應和洗脫體積，選擇合適的洗脫溶劑。實驗結果表明：環己烷由于洗脫強度較弱，無法有效洗脫六溴環十二烷；甲醇和乙腈雖能有效洗脫六溴環十二烷，但甲醇的洗脫雜質較多，基質效應嚴重；乙腈不易用氮氣吹干，在濃縮階段耗時長，降低了實驗效率；二氯甲烷不僅能有效洗脫六溴環十二烷，無明顯基質效應，且5 mL用量即能獲得完全有效洗脫，易于氮吹濃縮。實驗對比了不同二氯甲烷洗脫體積下六溴環十二烷的回收率，結果表明，3種六溴環十二烷的回收率相近，且回收率隨著洗脫體積的增大而增加，洗脫體積為5 mL時回收率達最大且趨于穩定。故實驗選擇洗脫溶劑為5 mL二氯甲烷。

2.5 線性范圍與定量下限

準確移取適量HBCD混合標準使用液和13C-HBCD內標標準使用溶液，用甲醇稀釋成0.50、1.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L系列標準工作液，標準工作液中的內標物質量濃度均為10.0 μg/L，除不加樣品外，按照樣品處理方法進行操作和測定。在最佳儀器條件下，得到3種六溴環十二烷的線性范圍均為0.50～100.0 μg/L，相關系數均大于0.995。分別在實際海洋生物體樣品中添加六溴環十二烷，按3倍信噪比確定方法的檢出限為0.06 μg/kg，按10倍信噪比確定方法的定量下限為0.20 μg/kg，不同海洋生物體中HBCD的信噪比無顯著差別，且回收率穩定，表明無明顯基質效應。

2.6 回收率與精密度

在陰性烏賊、貽貝、日本對蝦和紫菜樣品中添加3個不同濃度的六溴環十二烷標準溶液，按照本方法進行回收率實驗，每個濃度重復實驗6次，計算回收率和精密度(見表2)。結果表明，在0.5、2.5、10.0 μg/kg加標水平下，六溴環十二烷在樣品中的平均回收率為85.6%～97.3%，相對標準偏差(RSD)為3.9%～8.8%。2.5 μg/kg加標烏賊樣品的譜圖見圖2。

表2 六溴環十二烷的平均回收率及精密度(n=6)Table 2 Average recoveries and precisions for HBCDs(n=6)

2.7 實際樣品的測定

采用污染魚飼料投喂的暴露方式，以保證魚體對HBCDs的最大攝入和吸收。分別準確稱取魚飼料15 g，取1 mg/L的六溴環十二烷混合標準使用液1.5 mL,與5 mL丙酮混合，噴灑于15 g魚飼料。配制成0.1 μg/g的α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD污染飼料。在毒理培養室活性炭過濾的密閉循環水系統中進行試驗(室溫，白天28 ℃，晚間24 ℃，相對濕度70%)，設對照組和HBCDs暴露組，將供試青鳉魚馴養數天后進行實驗。暴露飼養時間為30 d，每天根據魚體數量投喂一定量的污染餌料和對照餌料，間隔固定時間取樣分析；取樣后的生物樣品，應立即稱重并真空冷凍干燥；采用本方法測定生物樣品中的HBCDs。結果表明：在加入各異構體HBCD喂養30 d 后，α-HBCD喂養組魚體肌肉中α-HBCD的濃度達到17.35 ng/g濕重；β-HBCD喂養組魚體肌肉中β-HBCD的濃度為3.40 ng/g濕重(見圖3)；γ-HBCD喂養組魚體肌肉中γ-HBCD的濃度為4.09 ng/g濕重。

圖2 2.5 μg/kg加標烏賊樣品的MRM圖Fig.2 MRM chromatograms of spiked(2.5 μg/kg) squid sample

圖3 β-HBCD喂養組青鳉樣品的MRM圖Fig.3 MRM chromatograms of feeding experiments with β-HBCD

3 結 論

海洋生物體中六溴環十二烷含量一般在μg/kg級，給試樣的分析提出了較高的要求。本方法采用液相色譜-串聯質譜法，具有較高的選擇性、靈敏度和準確性，輔以硅膠固相萃取凈化樣品，使方法定量下限達到0.20 μg/kg；對頭足類、貝類、甲殼類、藻類等海洋生物體進行不同濃度水平(0.5～10.0 μg/kg)的加標回收試驗，回收率為85.6%～97.3%，相對標準偏差為3.9%～8.8%。本方法穩定可靠，靈敏度高，重現性好，可滿足目前各實驗室對海洋生物體中六溴環十二烷的分析檢測要求及海洋監測規范對該濃度級別檢測方法的要求。

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