固相萃取/高效液相色譜-串聯質譜法快速測定飼料中的3種伏馬毒素

魏云計，馮 民，黃 娟，朱臻怡，何 健，沈金榮，何正和，秦 嫻，丁 濤

(1.淮安出入境檢驗檢疫局 國家飼料安全檢測重點實驗室(淮安)，江蘇 淮安 223001；2.江蘇出入境檢驗檢疫局 動植物與食品檢測中心,江蘇 南京 210001)

伏馬毒素(又稱煙曲霉毒素)屬真菌毒素，是由串珠鐮刀菌、多育鐮刀菌和輪狀鐮刀菌等產生的水溶性代謝產物[1-2]，為一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結構類似的雙酯化合物，主要污染糧食類農產品及其制品，尤其是玉米和玉米制品。目前發現的伏馬毒素至少有28種，分為A、B、C和P族4類，每種類型又分為不同亞型，野生型菌株中產量最豐富為B族伏馬毒素。伏馬毒素以B族的伏馬毒素B1、伏馬毒素B2和伏馬毒素B3為主要存在形式，其中伏馬毒素B1最常見，約占總量的70%，廣泛存在于玉米、小米等農作物中，是污染飼料的主要霉菌毒素之一，并且其毒性最強，對人類和動物會產生毒害作用。研究表明[3-5]，伏馬毒素可引起馬腦白質軟化癥、豬肺水腫綜合癥、誘發人體食道癌、肝癌。1993年，國際癌癥研究機構將伏馬毒素劃為2B類致癌物。目前，我國對伏馬毒素尚無明確的限量規定[6]，但許多國家對伏馬毒素已制訂了限量標準，歐盟對伏馬毒素(伏馬毒素B1和伏馬毒素B2)的總量進行了規定，玉米中限量為4 mg/kg，谷物類玉米基質早餐及玉米基質點心中的限量為0.8 mg/kg，嬰幼兒玉米制品中限量為0.2 mg/kg；美國FDA規定人類食用玉米中伏馬毒素總限量為2 mg/kg，FDA的畜牧醫學中心也發布了飼料中伏馬毒素的最高限量指導性公告，規定其限量為1～50 mg/kg，其中馬飼料限量為5 mg/kg，豬飼料限量為10 mg/kg，肉牛和家禽飼料為50 mg/kg；瑞士規定人類食物中伏馬毒素限量為1 mg/kg。

目前，國內外關于食品中伏馬毒素檢測方法的報道較多，主要有酶聯免疫吸附法[7-8]、氣相色譜法[9]、液相色譜法[10-13]、液相色譜-串聯質譜法[14-20]等。酶聯免疫吸附法操作簡單，快速，但靈敏度和準確度較低，易受到基質的干擾，出現假陽性結果；液相色譜法一般采用柱前或柱后衍生的方法進行測定，需配備衍生裝置，分析成本較高，檢測周期長；氣相色譜法需對目標物進行衍生化處理，方法穩定性較差；液相色譜-串聯質譜儀的選擇性好、抗干擾能力強、靈敏度高，已成為近年來霉菌毒素測定的首選方法。近幾年采用液相色譜-串聯質譜法測定飼料中伏馬毒素的國家標準及文獻分析的目標物一般為一種或兩種伏馬毒素，而3種伏馬毒素(B1、B2、B3)同時檢測的方法未見報道。本研究采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱有效去除基質中的蛋白質、磷脂干擾物，降低基質效應，結合液相色譜-串聯質譜儀選擇性好、抗干擾能力強、靈敏度高的特性，建立了飼料中3種伏馬毒素簡單、快速、高效的分析方法，方法的定量限能滿足國家對飼料中霉菌毒素的監控要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Scientific Accela液相色譜儀、TSQ Quantum Ultra EMR串聯質譜儀(美國Thermo公司)；Zorbax SB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國Agilent公司)；3K15低溫冷凍離心機(美國Sigma公司)；SB-5200DTD超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Oasis PRIME HLB小柱(60 mg/3 mL，美國Waters公司)。

乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸、乙酸銨(色譜純，美國Sigma公司)；實驗用水由Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)制備。伏馬毒素B1(FB1)、伏馬毒素B2(FB2)、伏馬毒素B3(FB3)標準品均購自Sigma公司。

1.2 標準溶液的配制

分別稱取各標準品10 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容，得到質量濃度為1.0 g/L的單標準儲備液，于-18 ℃冰箱中避光保存；取上述各標準儲備液，用乙腈稀釋成質量濃度為1.0 mg/L的混合標準工作液，于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 樣品前處理

稱取(5.00±0.05) g飼料于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈-水-甲酸(50∶49∶1)，在渦旋混合器上混勻30 s后，超聲提取15 min，以8 000 r/min離心5 min，取2 mL上清液，過PRIME HLB固相萃取柱，加入2 mL乙腈淋洗，收集全部流出液，于45 ℃水浴中氮吹至干，用1 mL乙腈-水(20∶80)溶解殘渣，混勻后經0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4 分析條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：A為乙腈，B為5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)；流速：250 μL/min；進樣量：25 μL。梯度洗脫程序：0～3.0 min，20%A；3.0～4.0 min，20%～60%A；4.0～8.0 min，60%～90%A；8.0～10.5 min，90%～20%A；10.5～13.5 min，20%A。

離子源：電噴霧離子(ESI)源，正離子掃描；離子源溫度：400 ℃；離子傳輸管溫度：350 ℃；噴霧電壓：3 000 V；鞘氣壓力：4.5 MPa；輔助氣壓力：1 MPa；多反應監測(MRM)方式檢測。其他質譜條件見表1。

表1 MRM監測模式下伏馬毒素的質譜參數Table 1 MS parameters of fumonisins in multiple reaction monitoring(MRM) mode

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

將質量濃度為1 mg/L的各化合物標準溶液通過蠕動泵分別直接注入質譜儀中，流速為5 μL/min。由于伏馬毒素為兩性化合物，實驗分別在正、負離子模式下進行一級質譜分析，兩種模式下化合物均有響應，通過對輔助氣、噴霧電壓、透鏡補償電壓等參數優化使之達到最高響應，結果發現正離子模式下的儀器響應遠高于負離子模式，因此采用正離子模式進行監測。選取[M+H]+作為母離子，再對每種物質的二級質譜進行碰撞能量、碰撞氣、透鏡補償電壓等參數優化，使每種物質的分子離子與特征碎片離子產生的離子對強度達到最大，選擇相對豐度最強，色譜峰無干擾的碎片離子為定量離子，其他離子為定性離子，優化后的參數見表1。

圖1 不同比例乙腈-水-甲酸對目標物回收率的影響Fig.1 Effect of different ratios of acetonitrile-water-formic acid on recoveries of the target compoundsratio of acetonitrile-water-formic acid(1-9):50∶49∶1；50∶48∶2；50∶47∶3;70∶29∶1；70∶28∶2；70∶27∶3；90∶9∶1；90∶8∶2；90∶7∶3

2.2 提取溶劑的優化

樣品中伏馬毒素常用的提取溶劑主要為甲醇、乙腈、甲醇水溶液、乙腈水溶液、酸性甲醇、酸性乙腈、酸性甲醇水溶液、酸性乙腈水溶液。實驗在相同的空白飼料樣品中添加50.0 μg/kg混合標準物質，考察了上述溶劑的提取效果，結果表明酸性乙腈溶液作為提取溶劑時回收率最高。這是因為伏馬毒素為兩性化合物，極性較強，其提取溶劑中加入甲酸和水可增加提取效率。為獲得最佳的提取效率，本實驗對乙腈-水-甲酸的混合比例進行優化，結果見圖1，以乙腈-水-甲酸(50∶49∶1)作為提取溶劑時，提取效率最高，故選其為本方法的提取溶劑。

2.3 凈化柱的選擇

飼料樣品提取后的基質干擾物較多，應用液相色譜-串聯質譜法測定伏馬毒素存在基質抑制效應，需對提取液進行凈化。目前，伏馬毒素常用的凈化柱主要有免疫親和柱、多功能凈化柱和固相萃取柱(HLB、MAX)。免疫親和柱基于抗體抗原反應，將特異性抗體連接在柱體內，選擇性吸附樣品中的待測物，而雜質不被吸附，柱上結合的目標物再被特定的洗脫液洗脫下來，具有高度特異性但價格較高。實驗選擇Multistep 211 Fum凈化柱、HLB、PRIME HLB、MAX固相萃取小柱分別對添加50.0 μg/kg混合標準溶液的飼料提取液進行凈化，外標法定量。比較回收率后發現，伏馬毒素在HLB小柱上的保留性差，用甲醇洗脫后，大量的雜質也被洗脫，凈化效果較差，回收率較低；Multistep 211 Fum凈化柱、PRIME HLB、MAX固相萃取小柱的凈化效果較好，回收率在60%以上，但Multistep 211 Fum凈化柱價格較PRIME HLB、MAX固相萃取小柱高，使用MAX固相萃取小柱需要活化及洗脫，步驟繁瑣，耗時較長。而PRIME HLB柱無需活化，提取液可直接過柱，操作簡單、快速，能夠有效去除基質中的蛋白質、磷脂干擾物，降低基質效應，回收率穩定，因此實驗最終選擇PRIME HLB小柱作為凈化柱。

2.4 基質效應的評價

LC-MS/MS分析中存在基質抑制或增強效應，基質效應影響檢測的靈敏度、精密度及準確度?；|效應以公式ME=(空白基質標樣的響應值/純溶劑標樣的響應值-1)× 100%計算。當ME為正值時表示基質增強，ME為負值時表示基質抑制，ME絕對值越大表示基質增強或抑制效應越強。消除基質效應的手段主要有優化前處理方法、使用同位素內標等。飼料基質較為復雜，雖通過凈化柱可去除大部分基質干擾，但仍存在一定的基質抑制效應。本實驗對基質效應的考察結果表明，FB1、FB2、FB3的 ME分別為-24%、-26%、-30%，存在明顯基質抑制效應。因此本文采用基質匹配曲線校正回收率，以降低基質效應的影響。

圖2 加標飼料(10 μg/kg)中伏馬毒素的MRM色譜圖Fig.2 Chromatograms of fumonisins in spiked feed samples(10 μg/kg)

2.5 線性范圍與定量下限

取適量的混合標準工作溶液，用空白基質溶液配制成質量濃度分別為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、250.0 μg/L的系列標準工作溶液，采用“1.4”優化的實驗條件進行測定。以目標物的峰面積為縱坐標(Y)，對應的質量濃度為橫坐標(X，μg/L)繪制標準曲線。結果表明，3種目標物在5.0～250.0 μg/L范圍內線性關系良好，FB1、FB2、FB3的相關系數(r2)分別為0.998 2、0.996 7和0.997 5。在空白飼料中添加混合標準品，以特征定量離子對色譜峰的信噪比(S/N)為3作為檢出限(LOD)，S/N=10作為定量下限(LOQ)，得到3種待測物的LOD均為3 μg/kg，LOQ均為10 μg/kg。目標物在定量下限加標水平(10 μg/kg)下的MRM色譜圖見圖2。

2.6 回收率與精密度

在空白飼料樣品中分別添加低、中、高(10、20、50 μg/kg) 3個水平的混合標準溶液，每個加標水平重復5次，用基質匹配曲線校正，外標法定量，得到方法的回收率及精密度。結果表明，目標物的平均回收率為80.3%～93.7%，相對標準偏差(RSD)為7.5%～13.4%(見表2)。

表2 飼料中伏馬毒素的加標回收率及相對標準偏差(n=5)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of fumonisins in spiked feeds(n=5)

2.7 實際樣品的檢測

采用本方法對65份飼料樣品進行測定，其中11份樣品檢出FB1，但含量(25.2～63.7 μg/kg)未超出FDA的規定，FB2、FB3未檢出。

3 結 論

本文建立了測定飼料中3種伏馬毒素含量的高效液相色譜-串聯質譜方法。采用乙腈-水-甲酸(50∶49∶1)溶液提取，PRIME HLB固相萃取小柱凈化。本方法操作快速、簡單，穩定性好，檢測成本低，方法的檢出限、回收率及精密度滿足國內外標準的要求，適用于飼料中3種伏馬毒素的定性與定量分析。

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