HPLC-MS/MS法測定嬰幼兒配方乳粉中膽堿、左旋肉堿、牛磺酸與肌醇

黃金鳳，尋知慶，汪晨霞，郭新東*，冼燕萍，盧宇靖，吳玉鑾

(1.廣州質量監督檢測研究院，廣東 廣州 511447；2.廣東工業大學 輕工化工學院，廣東 廣州 510006)

圖1 4種化合物的結構式Fig.1 Structures of four compounds

嬰幼兒配方乳粉因與母乳成分較接近而被用作母乳的替代品，膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇為嬰幼兒配方食品可選擇添加的營養物質[1-2](結構式見圖1)。其中，膽堿是強堿性有機物，為卵磷脂組成成分，在生物體內常以游離態或與卵磷脂、鞘磷脂等結合態形式存在，當體內膽堿不足時會導致生長受阻、營養不良、繁殖力差等；左旋肉堿結構與膽堿類似，其可促使長鏈脂肪轉化為能量，缺乏時會造成細胞能量代謝的紊亂，導致肌肉無力、脂肪堆積等；牛磺酸又稱α-氨基乙磺酸，能促進機體的激素分泌，增強和改善機體的免疫力，牛磺酸攝入不足會影響嬰幼兒的智力或引起腦的疾病；肌醇是一種水溶性維生素，易溶于水，廣泛存在于各種天然動物、植物及微生物組織中，能降低膽固醇、促進脂肪代謝等，并對脂肪肝、肝硬化、肥胖等疾病有治療和預防作用。成人所需膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇部分可由自身合成，也可通過食物補充，而嬰幼兒的各種器官未發育健全，自身合成量非常有限，絕大部分需通過食品補充。國家標準[1-2]規定了嬰幼兒配方食品中膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇的添加量，膽堿添加量為1.7～12.0 mg/100kJ，左旋肉堿添加量不低于0.3 mg/100kJ，牛磺酸添加量為0～3.0 mg/100kJ，肌醇添加量為1.0～9.5 mg/100kJ。因此，建立嬰幼兒配方食品中膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇的檢測方法十分必要。

現有國家標準GB 5413.20-2013[3]以比色法或分光光度法測定嬰幼兒食品或乳品中的膽堿；GB 29989-2013[4]使用分光光度法測定嬰幼兒食品或乳品中左旋肉堿。兩種方法均需酸或堿水解，將結合態或其它形式的膽堿、左旋肉堿均轉變為游離態，然后進行測定。GB 5009.169-2016[5]中使用鄰苯二甲醛(OPA)柱后衍生或丹磺酰氯柱前衍生高效液相色譜法測定牛磺酸，GB 5009.270-2016[6]規定了肌醇的微生物檢測或硅烷化衍生、氣相色譜檢測方法，但微生物法耗時長，衍生化法操作復雜，且高濃度的衍生劑較易殘留從而污染儀器。其它相關文獻報道的測定方法主要有高效液相色譜法[7-11]、氣相色譜法[12]、氣相色譜-質譜聯用法[13]、液相色譜-質譜聯用法[14-16]、離子色譜法[17-18]、電化學發光法[19]、氨基酸自動分析儀法[20]等，上述方法均僅涉及1～2種分析物，每種營養素建立一套獨立的檢測方法，耗時相對較長，檢測工作量大大增加。因此，本研究以嬰幼兒配方乳粉為研究對象，采用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白后直接用高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀檢測。方法前處理簡單快捷，其線性范圍、檢出限、穩定性、準確性均可滿足嬰幼兒配方乳粉中膽堿、左旋肉堿、肌醇和牛磺酸的分析要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

DIONEX Ultimate 3000 高效液相色譜儀-Thermal TSQ Endura三重四極桿質譜儀 (HPLC-MS/MS，熱電公司)，MS3 basic旋渦混合器(德國IKA公司)，KQ-250DV型數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，Milli-Q去離子水發生器(美國Millipore公司)，高速離心機(美國Sigma公司)。

標準品：氯化膽堿(純度為98.0%，CNW公司)、d9-氯化膽堿-三甲基(TRC)、左旋肉堿(純度≥98.0%，Dr.Ehrenstorfer公司)、d3-左旋肉堿鹽酸鹽(純度為98%，Cambridge Isotop公司)、肌醇(純度≥98.0%，CNW公司)、牛磺酸(純度≥98.0%，CNW公司)均購于上海安譜有限公司；甲醇、乙醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；乙酸銨、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀(分析純，廣州化學試劑廠)；實驗用超純水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q純水系統制備。

1.2 標準溶液的配制

分別稱取各標準品及內標10.0 mg(精確至0.1 mg )，置于100 mL 棕色容量瓶中，以水溶解并定容至刻度，得到質量濃度為100 mg/L 的單標儲備液。分別吸取適量的單標儲備液配制4種分析物的混合標準工作液，其中膽堿和左旋肉堿的質量濃度為1.0 mg/L，牛磺酸和肌醇的質量濃度為10.0 mg/L。臨用時，以水逐級稀釋成所需濃度的系列混合標準工作液。所有標準溶液于4 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品處理

準確稱取乳粉樣品0.20 g(精確至0.001 g)于100 mL比色管中，加入d9-氯化膽堿-三甲基和d3-左旋肉堿鹽酸鹽內標溶液(均為100 mg/L)各100 μL，加40 mL 40 ℃水溶解，渦旋1 min，超聲提取10 min，加入1 mL 15%亞鐵氰化鉀溶液，渦旋混合均勻后，再加入1 mL 30%乙酸鋅溶液，渦旋混合均勻，用水定容至100 mL，室溫靜置10 min后，取上清液于4 000 r/min離心3 min，經0.2 μm濾膜過濾后待檢測。當測試溶液濃度超出線性范圍時，可用水進一步稀釋后再測定。同時做試劑空白試驗(除不加樣品外，其它步驟相同)。

1.4 儀器條件

高效液相色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相：A為5 mmol/L 乙酸銨，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～3.0 min，15%B；3.0～5.0 min，15%～70%B；5.0～6.0 min，70%～15%B；后運行時間：2 min；流速：0.20 mL/min；進樣體積：5.0 μL；柱溫：30 ℃。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源，正負模式切換(ESI+和ESI-)；檢測方式：多反應監測(MRM)；干燥氣：氮氣，溫度400 ℃；傳輸毛細管溫度：350 ℃；毛細管電壓：3 500 V(正模式)和2 500 V(負模式)；相應的電離模式、監測離子對(m/z)、碰撞電壓和RF棱鏡參數見表 1。

表1 化合物的MRM參數Table 1 The multiple reaction monitoring conditions of the analytes

*quantitative ion

1.5 樣品分析物的含量計算

樣品中分析物含量計算如下：Xi=(Csi-C0)V/m。式中：Xi為試樣中待測目標化合物的含量(mg/kg)；Csi為待測試樣溶液中目標化合物的質量濃度(mg/L)；C0為空白試驗中目標化合物的質量濃度(mg/L)；V為濃縮至干后試樣的定容體積(mL)；m為試樣質量(g)。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇

2.2.1提取溶劑的選擇膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇水溶性好，可用水直接提取，但由于嬰幼兒配方乳粉中含有許多水溶性蛋白質和脂溶性營養成分，基質復雜，需凈化后檢測。脂溶性成分不溶于水，用水提取時只需將水溶性蛋白沉淀。實驗比較了乙腈、乙醇、乙酸、三氯乙酸、亞鐵氰化鉀/乙酸鋅等沉淀劑對蛋白質的沉淀效果。結果發現，乙腈和乙醇沉淀蛋白質緩慢，沉降不完全，樣品高速離心后也不澄清；乙酸和三氯乙酸對大多數乳粉樣品的蛋白質沉降效果較好，但部分乳粉樣品沉淀不完全；而亞鐵氰化鉀/乙酸鋅沉淀劑對所有樣品的沉淀效果好，低速離心后即可澄清。因此實驗采用亞鐵氰化鉀/乙酸鋅為沉淀劑。

2.2.2提取條件的選擇比較了振蕩提取和超聲提取兩種提取方法。結果表明，超聲提取操作簡便，提取效率較高。研究了超聲時間分別為5、10、15、20 min時的提取率，發現超聲10 min時，提取率基本達最大值，超聲時間超過10 min后對提取率無顯著影響。因此，確定超聲時間為10 min。

2.2 質譜條件的優化

膽堿和左旋肉堿均含有季銨鹽結構，分子帶正電荷；牛磺酸含有氨基，在酸性條件下易加氫形成正電荷化合物[M+H]+；肌醇含有6個羥基，易形成[M-H]-母離子，因此實驗選擇ESI正負切換電離模式，膽堿、左旋肉堿和牛磺酸使用ESI+模式，肌醇使用ESI-模式。實驗中以1.0 mg/L單標準溶液直接注入三重四極桿質譜儀，通過質譜自動優化MS/MS采集參數和特征碎片離子。表1列出了各化合物的母離子、子離子、RF棱鏡參數以及碰撞能量。在優化的碰撞能下，選擇每個母離子所對應豐度最大的子離子進行定量分析。

2.3 流動相條件的優化

ESI正負切換模式下檢測時，流動相多使用甲醇、乙腈和水。實驗比較了甲醇-水和乙腈-水流動相體系的分離效果，發現兩種流動相下分析物的響應強度差別不大，但采用甲醇-水體系的峰形明顯優于乙腈-水體系。此外，牛磺酸在兩種流動相體系下響應均不高，而在流動相中加入乙酸銨可明顯提高牛磺酸響應，且肌醇響應未見明顯降低；綜合考慮，實驗選擇甲醇-乙酸銨體系為流動相。考察了乙酸銨溶液濃度(3、4、5、6 mmol/L)對各組分分離度、響應值和峰形的影響。結果表明，乙酸銨溶液的濃度對4種組分的分離度、響應值無顯著影響。由于5 mmol/L乙酸銨溶液作為水相時的峰形最好，故選擇5 mmol/L乙酸銨溶液作為水相。

2.4 色譜柱的選擇

膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇均屬大極性親水化合物，在常規C18色譜柱上很難實現保留，因此需選用親水性色譜柱進行分離。實驗比較了ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和BEH HILIC(2.1 mm ×150 mm，1.7 μm)的分離效果。結果發現，雖然兩種色譜柱對4種化合物的保留效果均不強，但ACQUITY UPLC HSS T3保留時間的穩定性更優；由于4種化合物的提取離子色譜圖之間互不干擾，可通過提取離子對各化合物進行定量，因此選擇ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱。在優化的HPLC-MS/MS條件下，化合物的提取離子色譜圖如圖2所示。

2.5 線性方程及檢出限

在最優實驗條件下，取質量濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L的膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇混合標準工作溶液進行HPLC-MS/MS檢測，每個濃度標準工作液中均含100 μg/L的同位素內標溶液。膽堿和左旋肉堿采用內標法計算，以目標物定量離子峰面積(A)和內標物色譜峰面積(Ai)的比值(y)對相應的目標物質量濃度(x，mg/L)進行線性回歸分析；牛磺酸和肌醇采用外標法計算，以目標物定量離子峰面積(y)對相應的目標物質量濃度(x，mg/L)進行線性回歸分析，實驗結果見表2。結果表明，膽堿和左旋肉堿在0.01～2.0 mg/L質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數r2>0.999；牛磺酸和肌醇在0.1～2.0 mg/L質量濃度范圍內線性關系良好，r2>0.997。以3倍信噪比計算方法檢出限(LOD)，得膽堿和左旋肉堿的LOD為1.5 mg/kg，牛磺酸和肌醇的LOD為15 mg/kg；以10倍信噪比計算方法定量下限(LOQ)，得膽堿和左旋肉堿的LOQ為4.5 mg/kg，牛磺酸和肌醇的LOQ為45 mg/kg。本方法靈敏度高，適用于嬰幼兒配方乳粉中膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇的定性和定量分析。

表2 4種分析物的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量下限Table 2 Standard curves,linear ranges,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of 4 analytes

2.6 基質效應

基質效應是由樣品中復雜的干擾物抑制或增強分析物的響應導致，可用基質校準曲線的斜率與標準校準曲線斜率的比值進行評估[21-22]。由于左旋肉堿和膽堿使用內標法進行定量，內標校正了基質效應的影響，因此僅對牛磺酸和肌醇進行了基質效應研究。其標準曲線如表2所示，基質校準曲線可以通過使用樣品提取液作為溶劑獲得。結果表明，肌醇和牛磺酸的基質效應比值分別為0.91和0.87，表明兩者的響應可能被乳粉樣品中的干擾物質輕微抑制。考慮到嬰幼兒配方乳粉的復雜性，實驗得到的基質效應在可接受范圍內。

2.7 回收率與精密度

在最優實驗條件下，選取嬰幼兒配方乳粉樣品，分別添加3 個濃度水平的膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇混合標準工作液，按照本方法進行前處理和檢測，每個濃度水平平行測定6 次，計算平均回收率和相對標準偏差(RSD)，實驗結果見表3。4 種化合物在不同加標水平下的平均回收率為87.5%～102.4%，RSD為3.0%～7.3%。表明本方法精密度良好，能夠滿足嬰幼兒配方乳粉中膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇的測定要求。

表3 樣品的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs for analytes(n=6)

2.8 準確度

為驗證本方法的準確性，實驗采用質控樣品進行確證。采用本方法對美國國家標準與技術研究院奶粉質控樣品SRM 1849a進行3次平行檢測，結果表明，所有結果均在質控樣品含量范圍內(表4)。

2.9 實際樣品的測定

在市場上隨機挑選10個品牌的嬰幼兒配方奶粉(標簽上均標注了該4種成分的含量)，分別采用本方法以及現行有效的國家標準方法[3-6]進行測定。結果表明，兩種方法的測定結果一致(表5)，且測定結果均符合國家強制性產品標準及標簽明示值的要求。

表5 實際樣品的測定結果Table 5 Analytical results for the market samples (mg/100kJ)

a：obtained by national standard method；b：obtained by the developed method

3 結 論

本研究針對嬰幼兒配方乳粉中膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇尚缺少方便、快速同時檢測方法的現狀，利用同位素內標和HPLC-MS/MS，建立了嬰幼兒配方乳粉中該4種成分的同時檢測方法。結果表明，膽堿和左旋肉堿在0.01～2.0 mg/L范圍內，牛磺酸和肌醇在0.1～2.0 mg/L范圍內線性關系良好，膽堿和左旋肉堿的檢出限均為1.5 mg/kg，牛磺酸和肌醇的檢出限均為15 mg/kg。樣品基質加標測定結果表明該方法回收率高、精密度良好；質控樣品檢測以及實際樣品的測定結果表明方法準確度高，能滿足嬰幼兒配方乳粉中膽堿、左旋肉堿、牛磺酸和肌醇的定量檢測要求。

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