二維液相色譜法在線富集測定銀杏葉提取物中銀杏酸含量

杜小弟,李俊升,郭麗萍,雷家珩

(武漢理工大學 化學化工與生命科學學院 化學系，湖北 武漢 430070)

圖1 銀杏酸的結構式Fig.1 Structural formula of Ginkgolic acids

銀杏是中國特有的藥用植物，在延緩衰老、改善血液循環、治療心腦血管疾病等方面有一定療效[1-3]。但臨床發現銀杏可導致接觸過敏性皮炎，并存在潛在的細胞毒性、神經毒性等副作用[4-5]。研究認為，銀杏酸(Ginkgolic acids,GAs)是引起副作用的重要原因[6]。較為常見的銀杏酸包括GA13∶0、GA15∶1、 GA17∶2、GA15∶0和GA17∶1，其結構如圖1所示。

對于藥用標準的銀杏葉提取物(Extracts of Ginkgo biloba,EGB)，國外藥典不僅規定了其有效成分的含量，還限定了總銀杏酸的含量不得超過5 mg/kg[7-8]，我國藥典也有類似規定[9]。因此，需要建立一種檢測EGB及其制劑中銀杏酸含量的簡便、可靠、靈敏的方法。EGB中的銀杏酸可以通過液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、薄層色譜(TLC)等方法進行測定[10-11]。但薄層色譜的準確度和靈敏度均不高，氣相色譜法需衍生化處理[12]，僅液相色譜法應用最為廣泛。Fuzzati等[13]開發的提取液直接進樣、液相色譜紫外檢測器(HPLC/UV)測定銀杏酸的方法由于簡便性突出，且經過了完善的方法學確認，被采納為歐盟藥典中檢測EGB的標準方法[7]。然而該方法存在以下不足：①不經分離直接進樣，雖然方法簡便，但基體干擾較為顯著；②為提高靈敏度而使用較大的進樣量(50 μL)和較低的檢測波長(210 nm)，使得基體干擾和基線噪音問題更加突出，因此該方法在應用中仍需改進[14-15]。而且該方法的檢出限僅能夠滿足EGB中銀杏酸的限量檢測，對于含量更低的EGB制劑(如銀杏葉片、銀杏葉滴丸等)則難以測定。為提高測定的靈敏度、減小復雜基體的干擾，研究者嘗試使用液液萃取(LLE)[16]、固相萃取(SPE)[17]等方法以降低基體干擾，但操作較為繁瑣、耗時長。也有采用超高效液相色譜-串聯質譜聯用(UHPLC-MS/MS)測定微量銀杏酸的方法[18]，但儀器昂貴不便推廣。

近年來，在線二維色譜在中藥成分研究方面得到了廣泛應用[19]，以此為基礎的在線分離富集方法已有一定的研究[20-21]。有學者通過全二維色譜對銀杏成分進行定性研究[22]，但未進行定量分析。有文獻通過雙柱切換的方法測定銀杏葉中的銀杏酸含量[23]，在消除基體干擾方面有一定效果，但未能實現富集，難以適用于微量銀杏酸的測定。為減少基體干擾，同時實現微量銀杏酸的富集，本文搭建了在線二維色譜系統，將大體積的試樣通過第一維色譜分離實現富集和除去基體干擾，然后通過閥切換直接將目標物引入第二維色譜分離進行定量檢測，從而實現EGB及其制劑中微量銀杏酸的準確測定。

圖2 二維色譜系統的構成和閥切換示意圖Fig.2 Schematic of the two-dimensional liquid chromatography system and the valve switching

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

在線二維色譜系統由2臺LC-20AD高壓恒流泵(日本島津公司)、1臺SPD-20A紫外檢測器(日本島津公司)、1個7725i手動進樣閥(配300 μL定量環，美國Rheodyne公司)、1個7000型高壓切換閥(美國Rheodyne公司)和2根色譜柱組成，示意圖見圖2。其中柱1為ZORBAX Eclipse Plus-C18(2.1 mm×12.5 mm,5 μm)，柱2為ZORBAX Eclipse Plus-C18(2.1 mm×150 mm,5 μm)，均購于美國安捷倫公司。進樣閥、切換閥和色譜柱均安裝在CTO-10ASvp柱溫箱(日本島津公司)內。

EGB試樣為湖北盛天恒創公司生產，EGB制劑試樣為市售銀杏葉片藥物(金納多)。混合銀杏酸標準品購于武漢天植生物技術公司，總含量不低于99%，其中GA13∶0占10.1%，GA15∶1占50.5%，GA17∶1占34.7%，GA17∶2占1.7%，GA15∶0占3.0%。用甲醇溶解配制成總銀杏酸質量濃度為1.000 g/L的標準儲備液，4 ℃保存。使用時以甲醇-水-三氟乙酸混合液(體積比80∶20∶0.01)稀釋成所需濃度的工作標液。

甲醇、乙腈為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司)，三氟乙酸(純度99%，阿拉丁試劑上海有限公司)，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 色譜條件

泵1和柱1為第一維分離，流動相為甲醇-水-三氟乙酸混合液(體積比80∶20∶0.01)，流速0.25 mL/min。泵2和柱2為第二維分離，流動相為甲醇-水-三氟乙酸混合液(體積比90∶10∶0.01)，流速0.25 mL/min。柱溫均為30 ℃。紫外檢測器波長為310 nm。進樣量為300 μL(300 μL定量環全充滿)。切換閥處于圖2A所示狀態時，進樣4.5 min，后將切換閥切換至圖2B所示狀態。測定結束后切換回圖2A狀態，平衡2 min后進行下次測定。

1.3 實驗方法

樣品測定：準確稱取EGB樣品(或粉碎后的制劑樣品)0.500 g置于10 mL比色管中，加入甲醇8.0 mL，常溫下超聲提取10 min，加水定容至10.0 mL，用微量注射器加入三氟乙酸1.0 μL。混勻后用0.45 μm尼龍濾膜過濾，收集濾液，按“1.2”所述色譜條件進行測定。

樣品加標回收實驗：準確稱取EGB樣品(或粉碎后的制劑樣品)0.500 g置于10 mL比色管中，準確加入總銀杏酸質量濃度為0.100 g/L的工作標液25.0 μL(相當于樣品加標5 mg/kg)或50.0 μL(相當于樣品加標10 mg/kg)，后續操作與樣品測定相同。

1.4 對照方法

參照歐洲藥典EP8.0所述方法[8]：準確稱取EGB樣品0.500 g，用10.0 mL甲醇超聲提取，提取液過濾后直接進行色譜測定。色譜柱為Zorbax XDB-C8(4.6 mm×150 mm，5 μm，美國安捷倫公司)，流動相：A為0.01% 三氟乙酸乙腈溶液，B為0.01%三氟乙酸水溶液；梯度洗脫程序：初始為75%A，30 min線性改變至90%A；流速1.00 mL/min，檢測波長210 nm，進樣量50.0 μL。

2 結果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.1二維色譜系統的構建在圖2所示的二維色譜系統中，柱1進行第一維分離，使目標物與大部分基體干擾物分開。同時，通過大體積進樣，使目標物被吸附在柱1上，從而實現富集。通過閥切換將柱1接入第二維，通過第二維的流動相將柱1上富集的目標物洗脫，并在柱2上實現進一步的分離和定量檢測。第二維中的柱2為分析柱，參考文獻[14-19]中銀杏酸的測定方法，選擇十八烷基(C18)固定相，流動相為甲醇-水-三氟乙酸混合液(體積比90∶10∶0.01)。選擇2.1 mm內徑的窄內徑色譜柱，在相同的進樣體積下，獲得的靈敏度為4.6 mm標準內徑柱的4～5倍。

第一維中柱1除了達到預分離基體的目的外，還需對大體積樣品中的目標物進行富集，因此需對目標物有較強的保留能力,比較了十八烷基(C18)、辛烷基(C8)、氰基(CN)3種鍵合固定相的效果。C8和CN固定相對銀杏酸的保留能力較弱，富集效果差，需使用50 mm以上的長柱才能完全吸附大體積樣品中的目標物，但長柱導致目標物洗脫速度慢，峰展寬嚴重;而C18固定相對銀杏酸的保留較強，使用12.5 mm的短柱即可實現數百微升試樣中目標物的富集，且短柱可以被快速洗脫，峰形尖銳。

2.1.2第一維色譜條件的選擇第一維分離需要在柱1上將基體與目標物初步分離。為考察分離效果，分別測定了試樣溶液和標液在柱1上流出的色譜圖。當第一維以甲醇-水-三氟乙酸混合液(體積比80∶20∶0.01)為流動相時，所得色譜圖見圖3。此條件下，基體主要成分的流出時間約在4 min內，目標物銀杏酸的流出時間約在5 min后，基本可實現分離。當甲醇-水體積比降至70∶30時，雖然目標物的流出時間更長，但基體的洗脫相應變慢，且峰形拖尾更明顯，分離效果未改善。當甲醇-水體積比增至90∶10時，目標物流出太快，無法實現分離。

圖3 銀杏酸標樣(A)與EGB試樣基體(B)在第一維上的色譜圖Fig.3 Chromatograms of GAs standard(A) and EGB sample matrix(B) on the first dimension

圖4 樣品溶劑對色譜結果的影響Fig.4 Effect of solvent on chromatograms 3 μL injection of GAs standard sample(25.0 mg/L) with the solvent of methanol(a),and 300 μL injection of GAs standard sample(0.250 mg/L) in the solvent of absolute methanol(b),90% methanol(c),80% methanol(d)

根據圖3確定六通閥的切換時間為4.50 min。若切換時間提前，則會引入較多的基體組分，對第二維分離不利。若切換時間大于5.00 min，將導致目標物損失，使回收率顯著降低。

2.1.3試樣溶劑及進樣體積對富集效果的影響2.1 mm內徑的色譜柱進樣量通常不超過5 μL。為實現富集，第一維須大體積進樣。由于進樣體積很大時溶劑的洗脫作用會較為顯著，從而影響色譜結果。以甲醇為溶劑配制的GAs標樣(25.0 mg/L)在進樣體積為3 μL時，獲得的色譜圖見圖4a，其中除GA17∶1由于異構體的存在表現為雙峰外，其余4種目標物均具有尖銳的峰形。當使用GAs標樣(0.250 mg/L，甲醇溶劑)進樣300 μL時，由于溶劑甲醇的強洗脫作用，導致目標物在閥切換之前被洗脫，各目標物明顯損失，且峰寬顯著增大(見圖4b)。當溶劑中甲醇-水體積比為90∶10時(GAs濃度為0.250 mg/L)，溶劑的洗脫能力仍比流動相強，富集效果不佳，峰寬較大(見圖4c)。當溶劑中甲醇-水體積比為80∶20(GAs質量濃度為0.250 mg/L)，即溶劑與流動相組成一致時，溶劑的影響基本可以忽略，峰面積與圖4d接近，說明富集效果較好，靈敏度提高近100倍，而且峰形尖銳，與小體積進樣時的分離效果一致。

雖然大體積進樣可實現富集，但隨著進樣體積的增大，各目標物的峰形逐漸展寬。考察了半峰寬隨進樣體積的變化，結果表明當進樣體積在300 μL以下時峰寬變化不大，當進樣體積超過300 μL時峰寬增加較為明顯。因此選擇最佳進樣體積為300 μL。

2.2 方法學考察

通過配制不同含量的模擬樣考察了方法的線性范圍，以各目標物的峰面積對其含量進行線性回歸，結果見表1。5種銀杏酸在0.200～100.0 mg/kg范圍內均具有良好的線性關系，相關系數(r2)不低于0.998。配制一系列低濃度的銀杏酸標樣測定信噪比(S/N)，分別以S/N=3和S/N=10計算檢出限和定量下限(見表1)。5種銀杏酸的檢出限為0.02～0.06 mg/kg，定量下限為0.05～0.19 mg/kg。本方法不僅適用于EGB樣品中銀杏酸的測定，還適用于EGB制劑中更微量銀杏酸含量的測定。

表1 5種銀杏酸的線性關系、檢出限及定量下限Table 1 Linear relationship,limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) of 5 ginkgolic acids

*Y:peak area;X:mass concentration(mg/kg)

圖5 本方法對不同色譜柱的適應性Fig.5 Adaptability of this method to different columnsa.ZORBAX Eclipse Plus-C18,b.XDB-C18,c.Hypersil GOLD-C18,d.SinoChrome ODS-BP

進一步對方法的適應性和耐用性進行了考察。除“1.1”所述的色譜柱外，另選用了不同廠家不同型號的3種色譜柱，包括安捷倫公司XDB-C18、Thermo公司Hypersil GOLD-C18、大連依利特公司SinoChrome ODS-BP(柱尺寸規格與“1.1”相同)。4種色譜柱的分離效果對比見圖5。結果表明，不同型號的色譜柱雖對待測物的保留時間有所差異，但均能有效富集和分離，且分離效果和柱效均較理想，對GA13∶0的柱效不低于6 000理論塔板數，除GA17∶1的順反異構體外，其余各銀杏酸的分離度不低于1.5。實驗進一步考察了色譜條件發生微小變化時的分離效果，結果表明，檢測波長(±5 nm)、柱溫(±10 ℃)、流速(±0.05 mL/min)的微小變化對測定效果影響不明顯。以上實驗表明本方法具有較好的適應性和耐用性。

2.3 實際樣品檢測

取市售EGB試樣和EGB制劑試樣按本方法進行處理和測定，以銀杏酸純品作為對照樣進行定量，結果見表2。對照樣的色譜圖見圖6a，EGB試樣的色譜圖見圖6b。對于EGB試樣，本方法具有很好的重現性，各目標物測定結果的相對標準偏差(RSD)均不超過5.0%，總銀杏酸結果的RSD小于3.0%。對于EGB制劑，由于其中銀杏酸含量較低，GA15∶0未檢出，GA17∶2和GA17∶1能檢出但低于定量下限，對于含量較高的GA13∶0和GA15∶1可有效測定且RSD不超過5.0%，總銀杏酸結果的RSD為4.8%。

表2 EGB和EGB制劑試樣中銀杏酸含量的測定結果Table 2 Determination results of ginkgolic acids in EGB sample and EGB troche sample

*mean±SD,n=5;**mean±SD,n=5,measured by the control method described in Section“1.4”;***below the limit of quantitation

圖6 本方法測定EGB試樣和加標試樣的色譜圖Fig.6 Chromatograms of EGB sample and spiked EGB sample obtained by using proposed methoda.GAs standard sample(0.25 mg/L),b.EGB sample,c.spiked EGB sample at content level of 5 mg/kg for total GAs

考慮到藥典對EGB中總銀杏酸的限量為5 mg/kg[7-8]或10 mg/kg[9]，而實際樣品中的含量值一般與限量值接近，因此對EGB試樣進行了總銀杏酸為5、10 mg/kg兩個濃度水平的加標實驗，結果見表3。不同加標水平下，各目標物的回收率為94.0%～101.3%，總銀杏酸的回收率接近100%，表明方法具有較高的準確度。總銀杏酸5 mg/kg加標水平的色譜圖見圖6c。

圖7 對照方法測定EGB試樣的色譜圖Fig.7 Chromatograms of EGB sample obtained by using the control methoda.GAs standard(0.25 mg/L),b.EGB sample

以歐盟藥典方法[8]作為對照方法進行了對照實驗，結果見表2。對于單一銀杏酸，本方法測定結果與對照方法具有較好的一致性，且精密度優于對照方法。在靈敏度方面，對照方法的檢出限約為0.3～0.5 mg/kg，而本方法的檢出限約為對照方法的1/10，對于低含量的目標物GA17∶2和GA15∶0，本方法也可檢出，而對照方法難以檢出。因此，對于總銀杏酸的計算結果，本方法略高于對照方法，若不計入GA17∶2和GA15∶0的含量，則本方法與對照方法結果一致。用對照方法測定EGB試樣和對照樣的色譜圖見圖7，本方法通過第一維分離有效消除了基體干擾，使色譜圖基線更平直，干擾峰顯著減少。而且本方法通過在線富集使靈敏度顯著提高，采用更高的檢測波長(310 nm)使噪音和基線漂移比對照方法(檢測波長210 nm)顯著降低，因此在相同濃度水平下，本方法的信噪比顯著優于藥典方法。對于EGB制劑中微量銀杏酸的檢測，本方法更有效。

表3 EGB試樣中銀杏酸的加標回收率Table 3 Spiked recoveries of ginkgolic acids in EGB sample

*mean±SD,n=5

3 結 論

本文在自行搭建的二維液相色譜基礎上，建立了在線富集測定EGB及其制劑中微量銀杏酸的方法。該方法在有效消除基體干擾的同時實現了目標物的富集，檢出限為現行藥典方法的1/10。與LLE、SPE等離線富集方法相比，本方法的分離富集過程可通過閥切換自動完成，操作更簡便，速度更快，由于操作帶來的損失和不確定度更小。

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