鹽析輔助液液萃取交聯聚維酮凈化-靶向單一離子監測/高分辨質譜法測定蜂蜜中新煙堿類農藥殘留

呂 冰，辛少鯤，陳達煒，趙云峰

(國家食品安全風險評估中心/衛生部食品安全風險評估重點實驗室，北京 100021)

新煙堿類農藥是一種新型的廣譜性殺蟲劑，其對刺吸式口器害蟲防治作用明顯，是防治棉蚜、葉蟬及飛虱等害蟲的主要殺蟲劑[1]。近年來，因新煙堿類農藥的廣泛應用而導致的蜜蜂中毒現象屢有發生。研究表明，亞致死劑量的新煙堿類農藥雖不會直接導致蜜蜂死亡，但會影響蜜蜂的記憶系統，導致蜜蜂不能正常返回巢穴，同時會對蜜蜂的生殖、生長發育和工蜂采集等行為產生不良影響[2-3]。由于蜜蜂的大量死亡，可能影響農作物授粉，歐盟于2013年12月起限制使用吡蟲啉、噻蟲胺和噻蟲嗪3種新煙堿類農藥，2018年2月已完成新一輪新煙堿類農藥對蜜蜂危害的風險評估，并禁止戶外使用這3種新煙堿類農藥[4-6]。因此，建立蜂蜜中新煙堿類農藥的有效、快速的殘留檢測方法，以應對可能因新煙堿類農藥的禁用而導致的蜂蜜中此類農藥的風險評估具有重要意義。

圖1 交聯聚維酮(PVPP)的分子結構圖Fig.1 Molecular structure of PVPP

目前，新煙堿類農藥在環境、農產品及生物樣品中的測定方法主要有液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[7-10]、高效液相色譜配二極管陣列檢測器法(HPLC-DAD)[11]及毛細管電泳法(CE)[12]。其中，蜂蜜樣品的前處理方法主要包括液液萃取法(LLE)、固相萃取法(SPE)以及基于分散固相萃取(DSPE)的QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)法等[13-16]。其中，DSPE因簡便和價格低廉等優點而被廣泛應用，N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)和C18粉為其最常用的凈化吸附劑，如王東等[13]采用基于PSA為吸附劑的DSPE凈化方法測定蜂蜜中6種新煙堿類農藥。交聯聚維酮(Polyvinylpolypyrrolidone,PVPP，結構見圖1)是一種高分子量的交聯結構材料，其分子中具有酰胺鍵，易通過氫鍵效應吸附多酚類結構，常被用作啤酒和茶飲料等的穩定劑[17-18]。文獻曾報道采用PVPP替代PSA作為吸附劑去除茶葉中的酚酸類成分，其較PSA更高效且價格低[19]，但未見其在蜂蜜樣品中的應用。由于蜂蜜中新煙堿類農藥殘留水平較低，近年來，質譜技術成為其主要檢測手段。其中，隨著高分辨質譜-非靶向全掃描(Full scan,FS)檢測技術的發展，其越來越廣泛的應用于農藥多殘留體系的分析[20]。然而，在靶向分析中，高分辨質譜的FS檢測技術則遠遜于三重四極桿的多反應監測(MRM)技術。

基于上述研究背景分析，本研究進一步改進QuEChERS前處理技術，使用PVPP作為凈化吸附劑，基于鹽析輔助LLE-PVPP凈化，實現了蜂蜜中7種新煙堿類農藥的提取和凈化一步式樣品制備，可節省樣品前處理制備時間。在高分辨質譜的靶向分析中，采用靶向單一離子監測(Target single ion monitoring,TSIM)技術替代FS檢測技術，改進了儀器檢測分析的線性動態范圍和靈敏度。基于鹽析輔助LLE-PVPP的有效凈化和TSIM高靈敏度的檢測分析，建立了一種簡單、快速和高靈敏的蜂蜜中7種新煙堿類農藥的殘留分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜串聯四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(美國賽默飛公司)，渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)，冷凍離心機(美國Sigma公司)。

乙腈、甲醇(質譜級，美國Fisher Scientific公司)，甲酸、甲酸銨(HPLC級，美國Tedia公司)，其它試劑均為分析純；交聯聚維酮(PVPP，分析純，國藥試劑有限公司)；噻蟲胺、啶蟲脒、烯啶蟲胺、呋蟲胺、吡蟲啉、噻蟲嗪和噻蟲啉標準品(純度>98%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；內標噻蟲胺-d3、吡蟲啉-d4和噻蟲嗪-d3購自加拿大TRC公司；實驗用水為超純水，由美國Millipore公司純水儀制備。蜂蜜樣品購于北京各大超市和農貿市場。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取適量新煙堿類農藥標準品及內標(精確至0.000 1 g)于不同的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成100 mg/L或1 000 mg/L的標準儲備液，于-20 ℃儲存。新煙堿類農藥標準混合中間液(10 mg/L)和標準混合使用液(10、100、1 000 μg/L)由甲醇逐級稀釋標準儲備液制得。內標混合使用液(200 μg/L)由甲醇逐級稀釋內標儲備液制得。準確吸取新煙堿類農藥各標準混合使用液適量及內標混合使用液50 μL于10 mL容量瓶中，用25%乙腈水溶液定容，即得0.01～100 μg/L質量濃度范圍的系列標準工作液，臨用現配。

1.3 樣品制備

準確稱取蜂蜜樣品2 g(精確至0.001 g)，置于15 mL離心管中，加入100 μL內標混合使用液，渦旋混合30 s，以2 mL的25%氯化鈉水溶液溶解后，加入200 mg PVPP渦旋混合1 min，再加5 mL乙腈萃取，以5 000 r/min 離心5 min，取乙腈上清液0.25 mL，加水定容至1 mL，過0.22 μm有機微孔濾膜后，待測定。

1.4 儀器分析條件

色譜條件：BEH C18色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)，柱溫：40 ℃，流動相為甲醇(A)-水(B)體系，兩相中均含0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸銨，流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～3 min，20%A；3～7 min，20%～40%A；7～9 min,40%～100%A；9～9.1 min，100%～20%A；9.1～12 min，20%A。進樣體積：5 μL。

質譜參數：采用HESI離子化方式；噴霧電壓為3.5 kV；毛細管溫度為325 ℃；加熱溫度為350 ℃；鞘氣為40 arb，輔助氣為10 arb；掃描模式為TSIM/ddMS2模式，正離子采集；分辨率采用70 000 FWHM，AGC為2e5，Maximum IT為50 ms，MSX設為4，Isolation window為2 Da；ddMS2采集分辨率為17 500 FWHM，Loop Count為1，TopN為2，碰撞裂解能量(NCE)為30%。新煙堿類農藥的保留時間、母離子和碎片離子見表1。

表1 新煙堿類農藥的保留時間、母離子及子離子Table 1 Retention times(tR),precursor ions and fragment ions of neonicotinoids

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

比較了高分辨質譜技術中FS和TSIM的定量檢測模式。兩種定量檢測技術均以化合物的精確母離子進行定量，但相較于FS模式，TSIM模式是在更窄的質量掃描寬度(2 Da)下進行，從而產生較低的背景噪音。因此，在檢測性能方面，TSIM模式較FS模式具有更高的檢測靈敏度。7種新煙堿類農藥和3種同位素內標在低質量濃度水平(0.02 μg/L)TSIM模式下的提取離子色譜圖見圖2。在目標化合物的定性確證方面，通過ddMS2模式對母離子進行二級質譜碎裂，可在30%的NCE能量下獲取二級質譜碎片譜圖，目標化合物的二級質譜碎片離子信息見表1。

圖3 鹽濃度對新煙堿類農藥提取效率的影響Fig.3 Effect of NaCl concentrations on extraction efficiencies of neonicotinoids

2.2 樣品前處理方法的選擇

鹽析輔助LLE法在QuEChERS前處理技術中應用廣泛，其關鍵因素是在鹽析條件下，目標分析物在水相和有機相(乙腈)中的分配效率。本研究考察了不同鹽濃度(10%～30%)下7種新煙堿類農藥的提取效率。結果表明，10%的鹽濃度足以達到水與有機相之間的相分離，且鹽濃度對噻蟲胺、啶蟲脒、吡蟲啉、噻蟲嗪和噻蟲啉并無明顯影響，但隨著鹽濃度的增加，烯啶蟲胺和呋蟲胺的提取效率有所增加，但當鹽濃度大于25%時則無明顯變化(見圖3)。這可能歸因于烯啶蟲胺和呋蟲胺具有相對更大的極性，在水相中具有更高的分配比，通過增加鹽濃度，可以降低其在水相的分配系數，從而提高提取效率。當鹽濃度達到飽和后，提取效率達到平衡，此時提取效率可達92%。此外，水相體積也會影響目標物在兩相中的分配效率。本研究比較了用2 mL和4 mL的25%過飽和鹽溶液溶解蜂蜜樣品后，用5 mL乙腈進行LLE的提取效率，結果發現當體積由2 mL增至4 mL時，其他化合物的提取效率無明顯變化，但烯啶蟲胺和呋蟲胺的提取效率有所降低。因此，本研究采用2 mL的25%過飽和鹽溶液溶解蜂蜜樣品，以備下一步的提取凈化。

PVPP作為吸附劑對酚酸類物質具有較好的吸附效果，并得到一定應用[17-18]，這主要歸因于PVPP結構單元中具有內酰胺結構，含有N原子和O原子，其上的孤對電子能夠與活潑氫形成氫鍵效應，從而起到吸附作用。蜂蜜中含有的大量糖和酚酸類成分在鹽析輔助LLE的分配比不同，糖類因極性較大，在水層中分配比較高，而酚酸類成分的極性與新煙堿類農藥的極性相似，在乙腈層分配比較高，故通過鹽析輔助LLE法能夠去除絕大部分的糖成分，而酚酸類成分則無法去除。因此，乙腈層中仍含有酚酸類物質和少量的糖成分，文獻采用PSA進一步去除這些物質[13]。鑒于PVPP對酚酸類物質較佳的吸附效果以及低廉的價格(遠低于PSA吸附劑)，本研究通過在鹽析輔助的LLE過程中添加適量PVPP，以除去乙腈層中的酚酸類物質和少量的糖成分。該操作可簡化樣品的制備過程，實現一步式提取凈化，避免了因多步操作而導致的目標物損失。本研究進一步考察了PVPP用量(0～400 mg)對新煙堿類農藥提取效率的影響。結果發現，PVPP的添加不會對新煙堿類農藥形成吸附，可以作為凈化吸附劑；且在蜂蜜未添加PVPP情況下，啶蟲脒、吡蟲啉和噻蟲啉具有一定的基質增強效應(1.22～1.27之間)，而添加適量PVPP凈化后，基質效應有所改善(0.99～1.03之間)，當PVPP用量達到200 mg時可獲得最佳的基質效應改善效果。繼續增加PVPP用量至400 mg，凈化效果無改善且不會對目標物有明顯吸附。考慮到價格成本，本研究采用添加200 mg的PVPP進行凈化。

反相液相色譜的溶劑效應對中、高極性化合物的色譜行為具有一定影響，本研究考察了純乙腈樣品溶液、50%乙腈樣品溶液和25%乙腈樣品溶液進樣5 μL時7種新煙堿類農藥的色譜行為。結果發現烯啶蟲胺和呋蟲胺在純乙腈和50%乙腈下的溶劑效應明顯，而在25%乙腈下色譜行為良好，無明顯溶劑效應。因此，本研究對乙腈提取液用純水稀釋4倍(25%乙腈)，以改善溶劑效應的影響。

2.3 基質效應

基質的存在可能會導致離子強度的增強或抑制，從而影響濃度的準確測定。稱取蜂蜜樣品按照“1.3”方法處理，檢測未發現其中含有痕量目標化合物，從而得到蜂蜜樣品空白基質提取液。然后用蜂蜜基質提取液及25%乙腈水溶液配制得到質量濃度為0.01～100 μg/L的基質混合標準液和純溶劑混合標準液，以各組分的峰面積對溶液質量濃度繪制標準曲線。依據基質標準溶液和溶劑標準溶液之間的標準曲線斜率比值評價基質效應，斜率比值越接近1.0說明基質效應越弱。當平均基質效應(增強或抑制)大于0.2(即0.8～1.2之間)時，認為基質效應對定量檢測有顯著影響，不可忽略。

按照上述方式評價本方法的基質效應，結果如表2所示，蜂蜜基質對目標化合物檢測的基質影響的斜率比值在0.92～1.05之間，說明本方法中蜂蜜對7種新煙堿類農藥測定存在較弱的基質效應影響，但其影響均低于0.2，可以忽略不計，因此本實驗選擇溶劑標準曲線進行定量分析。

表2 分析物的線性、檢出限、定量下限和基質效應Table 2 Linear ranges,linear equations,LODs,LOQs and matrix effects of analytes

Y:peak area ratio of the analyte to the internal standard;X:mass concentration of the analyte,μg/L

2.4 線性范圍與定量下限

配制質量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的系列混合標準溶液，內標法定量，每個濃度水平添加同位素內標1 μg/L。以系列標準溶液質量濃度為橫坐標(X,μg/L)，以各組分分別與同位素內標的提取離子色譜峰的峰面積比值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，結果見表2。噻蟲胺、吡蟲啉、噻蟲啉在0.01～100 μg/L范圍內，啶蟲脒、烯啶蟲胺、呋蟲胺、噻蟲嗪在0.02～100 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于 0.999。

圖4 新煙堿類農藥在不同濃度水平下的相對平均偏差Fig.4 Relative average bias of neonicotinoids at different concentration levelsA.TSIM mode;B.FS mode

本研究考察了7種新煙堿類農藥在不同采集模式(TSIM和FS)下的線性動態范圍和各濃度點的相對平均偏差。從圖4可見，在TSIM采集模式下，各組分的線性動態范圍約為104，而低水平標準溶液的相對平均偏差(即通過標準曲線計算得到的濃度值與理論濃度值之間的偏差)低于15%(圖4A)；而在常規的FS采集模式下，各組分的線性動態范圍約為103，遠低于TSIM模式，且FS模式在低濃度分析(0.1 μg/L)時，7種新煙堿類農藥的相對平均偏差為12%～65%，僅當濃度水平達到0.5 μg/L時，才能獲得可接受的相對平均偏差(<20%)(圖4B)。因此，采用TSIM采集模式，通過標準曲線線性范圍的拓寬，可滿足濃度差異較大的實際樣品的檢測需要，提高檢測效率。以低水平加標空白樣品測試方法的檢出限和定量下限，根據3倍和10倍信噪比(S/N)分別確定化合物的方法檢出限和定量下限。測得本方法中新煙堿類農藥在蜂蜜中的檢出限(LOD)為0.03～0.07 μg/kg，定量下限為0.1～0.2 μg/kg (表2)。各組分的定量下限遠低于歐盟規定的7種新煙堿類農藥在蜂蜜中的最大殘留限量(10～50 μg/kg[21])。

2.5 準確度與精密度

以空白蜂蜜樣品作為基質，選取歐盟規定的新煙堿類農藥最大殘留限量范圍的20 μg/kg為最高加標水平，選取接近定量下限水平的0.2 μg/kg為低加標水平，選取中間濃度2 μg/kg為中加標水平，進行加標回收實驗，考察方法的準確度和精密度。每個加標水平日內平行測定6次，日間平行測定5次。結果顯示，7種組分在3個加標水平下的平均回收率為84.8%～112.7%，日內精密度(RSDr)為0.9%～5.7%，日間精密度(RSDR)為3.7%～9.7%(見表3)。方法的準確度和精密度良好。

表3 不同加標濃度下新煙堿類農藥的回收率與精密度Table 3 Recoveries and precisions of neonicotinoids at different spiked levels

2.6 實際樣品的測定

采用已建立的方法對市售的66份蜂蜜樣品進行檢測，結果顯示啶蟲脒和吡蟲啉的檢出頻率最高，檢出率分別為22.7%(15份)和37.9%(25份)，但均未超過歐盟規定的蜂蜜中的最大殘留限量，其中啶蟲脒的檢出含量為0.20～13.44 μg/kg，平均值為2.42 μg/kg，中位數為0.87 μg/kg；吡蟲啉的檢出含量為0.10～4.83 μg/kg，平均值為0.61 μg/kg，中位數為0.26 μg/kg；1份樣品檢出噻蟲嗪，含量為0.50 μg/kg；2份樣品檢出噻蟲啉，含量分別為0.14 μg/kg和0.18 μg/kg。所有樣品均未檢出噻蟲胺、烯啶蟲胺和呋蟲胺。上述結果表明，本方法靈敏度高，樣品處理快捷簡便，凈化效果好，適用于蜂蜜中新煙堿類農藥的快速測定。

3 結 論

本研究基于鹽析輔助LLE-PVPP凈化-TSIM/高分辨質譜靶向檢測技術，建立了蜂蜜中7種新煙堿類農藥殘留的測定方法。該方法可實現提取凈化一步式樣品制備，且樣品前處理時間短，操作簡單、成本低、凈化效果良好；進一步采用TSIM靶向檢測技術，改善了高分辨質譜檢測的靈敏度以及檢測結果的準確度與穩定性。本方法能滿足蜂蜜中新煙堿類農藥殘留檢測的要求，為我國蜂蜜產品中此類農藥殘留的常規監測和風險評估提供了可靠的技術手段。

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