GC-MS/MS測定山藥中樂果等三種農藥殘留的一測多評研究

魏長勇,余敏靈

（樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川樂山 614000）

中藥材種植及中藥飲片加工儲存過程中農藥的不當使用，均會影響其質量，嚴重危害人體健康[1]?！吨袊幍洹?015年版四部收載了多種農藥殘留的氣相色譜檢查方法[2],近年來，對農藥殘留量研究報道的文獻大多以氣相、液相色譜或以其與質譜的聯用為主[3-8],我們應用GC-MS/MS法根據色譜保留時間和質荷比信息對樣品進行定性分析，以樂果二級離子掃描色譜峰(125.0/79.0)面積為參照，計算其與敵敵畏二級離子掃描色譜峰（185.0/93.0）面積和毒死蜱二級離子掃描色譜峰（313.9/257.9）面積的校正因子，建立GC-MS/MS測定山藥[9]中樂果等三種農藥殘留的一測多評方法，收到了滿意的結果，現將實驗結果報道如下，以期為GC-MS/MS測定農藥殘留量提供一測多評[10-12]研究思路。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

GCMS-TQ8030氣質聯用儀(島津中國科技有限公司)；Rxi-5SilMS，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm毛細管柱，工作站為LabSolutionsGCMSSolutions版本4.20(島津中國科技有限公司);Cleanert TPH凈化柱(天津博納艾潔爾公司)。

樂果、敵敵畏、毒死蜱標準品溶液（規格：100μg·mL-1，批 號 ：樂 果 GSB05-2286-2016,敵 敵 畏GSB05-2298-2016,毒死蜱 GSB05-1849-2016，農業部環境監測保護研究所）。乙腈、丙酮均為色譜純，氯化鈉、無水硫酸鈉均為優級純。山藥樣品由四川龍馬藥業有限公司提供，按《中國藥典》2015年版一部鑒定為山藥（Dioscoreae Rhizoma），批號分別為20160527、20160602、20170613。

1.2 方法

1.2.1 測定原理

以樂果為對照品，利用樣品色譜圖中樂果色譜峰和敵敵畏色譜峰、毒死蜱色譜峰相對保留時間進行定位[2]；二級離子碎片圖譜中樂果在47、62、79有碎片離子峰(豐度比為155∶13∶100，以79為參比)，敵敵畏二級離子碎片圖譜中在63、93、109有碎片離子峰(豐度比為24∶100∶25，以93為參比)，毒死蜱二級離子碎片圖譜中在194、258、286有碎片離子峰(豐度比為24∶100∶49，以258為參比)；通過定位和二級離子碎片圖譜碎片離子峰以及其豐度比對樂果、敵敵畏、毒死蜱色譜峰進行定性分析。在定量分析時，通過精密量取樂果、敵敵畏、毒死蜱標準品溶液各適量，配制成不同濃度的混合溶液，按設定條件進樣，記錄色譜圖，繪制樂果、敵敵畏、毒死蜱進樣量對其峰面積的回歸曲線，以樂果回歸曲線斜率與敵敵畏、毒死蜱回歸曲線斜率的比計算校正因子(fs/k=Ks/Kk)，通過樂果回歸曲線計算樂果含量，通過校正因子及樂果回歸曲線計算敵敵畏、毒死蜱含量。

1.2.2 測定條件

采用Rxi-5SilMS，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm毛細管柱，進樣口溫度：250℃；線速度：47.2cm/sec；程序升溫：50℃保持1 min，以25℃/min速率升至125℃，再以10℃/min速率升至300℃，保持15 min。進樣體積：1 μL。載氣：高純氦氣(＞99.999%)。

離子源溫度200℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時間5 min；碰撞氣氬氣（純度大于99.999%）；電離方式見表1。

表1 電離方式

1.2.3 標準儲備溶液的制備

精密量取樂果、敵敵畏、毒死蜱標準品溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備溶液（每1 mL含樂果、敵敵畏、毒死蜱各10 μg）。

1.2.4 樣品溶液的制備

分別取三個批號山藥樣品（批號為20160527、20160602、20170613）約50 g，粉碎成粉末（過三號篩），分別取粉末約1 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，15 000r/min勻漿提取1 min，加入2 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，4 200 r/min離心5 min，取上清液于150 mL雞心瓶中，再于離心管中加入15 mL乙腈，按上述方法重復勻漿提取一次，合并提取液，于40℃水浴旋轉蒸發至約1 mL。Cleanert TPH固相萃取柱上加入約2 cm無水硫酸鈉，用10 mL正己烷-丙酮(6∶4)預洗后，將樣品濃縮液移入柱中，用25 mL正己烷-丙酮(6∶4)洗脫，收集洗脫液于40℃水浴旋轉濃縮至近干，用丙酮定容至1 mL，0.2 μm濾膜過濾，即得。

1.2.5 樣品加標溶液的制備

精密稱取山藥粉末1.020 1 g，按1.2.4項下樣品溶液的制備方法，從“置50 mL離心管中起到收集洗脫液于40℃水浴旋轉濃縮至近干”，加標準儲備溶液5 μL，用丙酮定容至1 mL，0.2 μm濾膜過濾，即得。

1.2.6 專屬性試驗

精密量取標準儲備溶液250 μL至5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。按1.2.2項下測定條件，取對照品溶液、樣品溶液、樣品加標溶液分別進樣，記錄色譜圖。

1.2.7 線性關系考察

精密量取標準儲備溶液50、100、200、250、300、400、500 μL，分置7個5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按1.2.2項下方法測定，以樂果二級離子掃描（125.0/79.0）峰面積A與樂果進樣量m(ng)進行線性回歸。

1.2.8 f值和t值的計算

通過以樂果回歸曲線斜率與敵敵畏、毒死蜱回歸曲線斜率的比計算校正因子（fsk=Ks/Kk），以保留時間比值計算t值。

1.2.9 精密度試驗

精密量取標準儲備溶液200 μL至5 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。按1.2.2項下測定條件重復進樣6次，測定峰面積。

1.2.10 穩定性試驗

取1.2.5項下樣品加標溶液，按1.2.2項下測定條件分別在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h進樣，測定峰面積。

1.2.11 檢出限與定量限

精密量取樂果、敵敵畏和毒死蜱標準品溶液各1 mL,用丙酮稀釋制成樂果、敵敵畏和毒死蜱質量濃度各為10 μg·mL-1的單一成分溶液，分別精密量取上述單一成分1、0.1、0.1 mL,置同一10 mL量瓶中定容，逐級稀釋，按1.2.2項下測定方法進樣，以信噪比（S/N）的3倍計算最低檢出限、10倍計算最低定量限。

1.2.12 回收率試驗

精密稱取1.2.4項下粉末9份，每份約1 g，分置9個50 mL離心管中，分為3組，每組3份，每組分別加標準儲備溶液40 μL、50 μL、60 μL，按1.2.4項下方法制備樣品溶液，取樣品溶液按1.2.2項下測定條件分別進樣，記錄圖譜，按回歸方程A=615311 m-173計算供試品中樂果含量；按校正方程A敵敵畏=615311 mf敵敵畏/樂果-173計算敵敵畏含量，按校正方程A毒死蜱=615311 mf毒死蜱/樂果-173計算毒死蜱含量。

2 結果

2.1 專屬性試驗

在對照品溶液二級離子掃描色譜譜圖中有樂果二級離子掃描(125.0/79.0)、敵敵畏二級離子掃描(185.0/93.0)和毒死蜱二級離子掃描(313.9/257.9)色譜峰，保留時間敵敵畏5.690 min、樂果10.663 min、毒死蜱13.191 min，在樣品溶液色譜圖中沒有上述色譜峰，在樣品加標溶液色譜圖中有和對照品溶液色譜圖中保留時間一致的樂果、敵敵畏、和毒死蜱二級離子掃色譜峰（見圖1）；對照品溶液和樣品加標溶液的二級離子碎片圖譜中樂果在47、62、79處(豐度比：155∶13∶100，以79為參比)，敵敵畏在為63、93、109處(豐度比：24∶100∶25，以93為參比)，毒死蜱在194、258、286處(豐度比：24∶100∶49，以258為參比)，均有二級離子碎片峰（見圖2）。

圖1 二級離子掃描色譜圖

圖2 二級離子碎片圖譜

2.2 線性關系

按實驗測得樂果二級離子掃描峰(125.0/79.0)、敵敵畏二級離子掃描峰(185.0/93.0)、毒死蜱二級離子掃描峰(313.9/257.9）峰面積與各自進樣量在0.1～1 ng范圍內有較好的線性關系；得回歸方程樂果為A=615 311 m-173,r=0.9 998(n=7)，敵敵畏為A=2 016 535 m-203，r=0.9 997(n=7)，毒死蜱為A=1 278 304 m-68，r=0.9 993(n=7)。

2.3 f值和t值的計算

計算得敵敵畏色譜峰峰面積和樂果色譜峰峰面積的校正因子f敵敵畏/樂果=2 016 535/615 311=3.277 3，相對保留時間t敵敵畏/樂果=5.690/10.663=0.533 6；毒死蜱色譜峰峰面積和樂果色譜峰峰面積的校正因子f毒死蜱/樂果=1 278 304/615 311=2.077 5，相對保留時間t毒死蜱/樂果=13.191/10.663=1.237 1。

2.4 精密度試驗

測得樂果、敵敵畏、毒死蜱二級離子掃描色譜峰峰面積的RSD（n=6）分別為0.3%、0.7%、0.5%。

2.5 穩定性試驗

結果表明，在0、2、4、8、12、14、16、20、24 h時測得的樂果、敵敵畏、毒死蜱二級離子掃描色譜峰峰面積變化不大，RSD分別為0.8%、1.1%、0.7%。

2.6 檢出限與定量限

結果表明，當取質量濃度為0.02、0.002和0.002 ng·μL-1的混合溶液進樣分析時，測得樂果、敵敵畏、毒死蜱的信噪比（S/N）分別為27.52、35.10、32.26，計算得最低檢出限（以進樣量計）：樂果為2.18×10-3ng、敵敵畏為1.71 × 10-4ng、毒死蜱為1.86×10-4ng；最低定量限（以進樣量計）：樂果為7.27×10-3ng、敵敵畏為5.70×10-4ng、毒死蜱為6.20×10-4ng。

2.7 回收率試驗

結果表明，樂果平均回收率為99.3%，RSD為1.5%，敵敵畏平均回收率為99.4%，RSD為1.4%，毒死蜱平均回收率為99.6%，RSD為1.5%。

2.8 樣品測定

樣品測定結果顯示：3批樣品未檢測出樂果殘留量、敵敵畏殘留量、毒死蜱殘留量。

3 討論

當色譜條件有細微改變時，相對保留時間有細微變化，但在該試驗中，被測定物質的定性主要采用二級離子碎片峰及其豐度比確認，所以對相對保留時間的耐受性沒有進行考察。

我們對多種藥材農藥殘留的含量測定進行了研究，發現由于中藥材含有多種成分，某些成分對測定會有一些干擾，所以在測定具體某一品種時應設計具體的試驗參數，并進行相應方法學論證。

GC-MS聯用法和GC-串聯MS（MS/MS）聯用法既具有GC的高分離效能，又具有MS可鑒定化合物結構的特點，可同時快速測定樣品中多種殘留農藥及其衍生物。

我們采用的一測多評法是以一種對照品，建立該成分與其他成分間的相對響應因子，通過相對響應因子來計算其他成分含量的一種質量控制方法。該法具有成本低、效率高等優點，能有效解決多指標質量控制面臨的對照品短缺、不易獲得和檢測成本相對昂貴等問題。

1. 孔令軍，張婭婷，谷令彪，等.中藥材農藥殘留的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2015,21(21):231-234.

2. 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京:中國醫藥科技出版社,2015:209-223.

3. 程志，張蓉，劉韋華，等．氣相色譜-串聯質譜法快速篩查測定中藥材中144種農藥殘留[J]．色譜，2014,1(32):57-68.

4. 達晶，王剛力，曹進，等.農藥殘留檢測標準體系概述及其分析方法進展[J]．藥物分析雜志，2014，5(34):760-769.

5. 殷玉杰，夏秀萍，毛福英，等.藥用植物中農藥殘留檢測技術的研究進展[J]．中國藥房，2017，28(12):1 271-1 275.

6. 閆震，聶繼云，徐國鋒，等.超高效液相色譜-串聯質譜法對比4種凈化方式對不同色素含量基質中19種農藥殘留檢測的影響[J]．分析測試學報,2014,33(9)：1000-1009.

7. 國金玲，張朔生.氣相色譜-質譜聯用技術在藥品及食品分析中的應用[J]．中國藥事，2016,30(6):560-563.

8. 劉嬌，劉雪峰，樊寶娟.GC-MS法測定18種藥材中的農藥殘留量[J]．西北藥學雜質,2017,1(32):9-13.

9. 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京:中國醫藥科技出版社,2015:28-29.

10. 徐賽華，沈昱翔.一測多評法測定重樓藥材中4種皂苷類成分含量[J].醫藥導報,2017,9(36):1 029-1 033.

11. 呂邵娃，于風明，蘇紅，等.中藥材一測多評中相對校正因子的規范性文獻調查和分析[J]．中國藥房,2016,27(15):2 020-2 023.

12. 陳楊，徐光臨，徐德生，等.一測多評法在中藥質量中的控制及關鍵問題[J]．環球中醫藥,2017,10(5):635-640.