紫地榆活性成分對(duì)致齲菌生長和產(chǎn)酸影響的體外研究

王麗梅，楊曉珍，藍(lán) 海*

（1.大理白族自治州人民醫(yī)院口腔科，云南大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

齲病是在多因素影響下的牙齒硬組織發(fā)生的慢性疾病。其中致齲菌產(chǎn)酸可導(dǎo)致羥基磷灰石晶體溶解，無機(jī)鈣、磷離子移出等，因此致齲菌產(chǎn)酸是釉質(zhì)脫礦、發(fā)生齲損的主要原因。齲病表現(xiàn)為無機(jī)質(zhì)的脫礦和有機(jī)質(zhì)的分解，病變過程是一個(gè)脫礦與再礦化交替進(jìn)行的過程〔1〕。紫地榆（Geranium strictipesR.Knuth）是牻牛兒苗科老鸛草屬植物，其根入藥，能消積食。有文獻(xiàn)報(bào)道，紫地榆提取物能抑制牙釉質(zhì)脫礦并能促進(jìn)牙釉質(zhì)再礦化〔2-8〕。紫地榆的乙酸乙酯提取物和水提物均能有效抑制口腔中變形鏈球菌和血鏈球菌的生長和產(chǎn)酸〔9-11〕。本文旨在研究紫地榆活性成分對(duì)常駐口腔細(xì)菌的生長及產(chǎn)酸的影響。

1 材料

變形鏈球菌（批號(hào)：ATCC25175）、粘性放線菌（批號(hào)：ATCC27044）菌種購于廣東微生物菌種保藏中心；TPY液體培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司；沒食子酸，五倍子酸甲酯，兒茶素，鞣花酸，0.05%醋酸洗必泰（chlorhexidine acetate，CA），0.5、0.1 mol∕L氫氧化鈉，葡萄糖，蔗糖，0.5 mol∕L磷酸鹽緩沖液（PBS），無水乙醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，三氯甲烷，以上試劑均為分析純。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)溶液的制備 將紫地榆的4種活性成分溶于TPY液體培養(yǎng)基中，使其最終濃度為16.000 g∕L，使用時(shí)按2倍稀釋法〔12〕稀釋。

2.2 菌液的制備 將細(xì)菌復(fù)蘇48 h后接種于TPY液體培養(yǎng)基中于厭氧條件下（37℃，80%N2、20%CO2）培養(yǎng)18 h進(jìn)行增菌。經(jīng)鑒定為純培養(yǎng)后，離心，取菌體用無菌生理鹽水洗滌3次。調(diào)整2種細(xì)菌的菌懸液濃度約5×107CFU∕mL。

2.3 2種致齲菌最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）的測定 配制含有紫地榆活性成分的液體培養(yǎng)基，按2倍稀釋法調(diào)整活性成分的濃度在0.125 g∕L至16.000 g∕L。在培養(yǎng)皿中接種細(xì)菌，菌懸液：含活性成分的培養(yǎng)基=1：1（V∕V），厭氧培養(yǎng)48 h。結(jié)果以肉眼觀察無菌生長的紫地榆活性成分濃度確定為該活性成分對(duì)該細(xì)菌的最低抑菌濃度。選擇大于最低抑菌濃度的各孔，取20 μL涂布于固體培養(yǎng)基上，肉眼觀察菌落數(shù)少于5～6個(gè)的紫地榆活性成分濃度為最低殺菌濃度。

2.4 紫地榆活性成分對(duì)2種口腔常駐細(xì)菌產(chǎn)酸能力影響的測定 根據(jù)“2.3”項(xiàng)下的測定結(jié)果，將含活性成分的液體培養(yǎng)基配成最低抑菌濃度以下4個(gè)濃度梯度，陽性對(duì)照組為0.05%醋酸洗必泰，陰性對(duì)照組為不含藥物的空白組，共6組，每組設(shè)3個(gè)平行管。將初始pH值調(diào)為7.4，菌懸液：含活性成分的培養(yǎng)基=1：1（V∕V），厭氧培養(yǎng)48 h。用pH計(jì)測定上清液的pH值并計(jì)算其pH的變化值△pH〔13-14〕。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，采用單因素方差分析比較各組總體均數(shù)，用Dunnett T3檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)間兩兩比較，α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 紫地榆活性成分對(duì)2種口腔常駐細(xì)菌生長的影響 從表1可以看出，紫地榆活性成分對(duì)變形鏈球菌和粘性放線菌均有生長抑制和殺菌作用。

表1 紫地榆活性成分對(duì)2種口腔常駐細(xì)菌的MIC和MBC值（g∕L）

3.2 紫地榆活性成分對(duì)2種口腔常駐細(xì)菌產(chǎn)酸作用的影響 由表2可見各濃度實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比均具有抑制產(chǎn)酸的作用，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且隨著濃度升高，其抑制產(chǎn)酸作用逐漸增強(qiáng)；1∕2MIC兒茶素組對(duì)變形鏈球菌和粘性放線菌的產(chǎn)酸抑制效果與陽性對(duì)照組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)酸抑制效果均不如陽性對(duì)照組（P＜0.05）；不同濃度的同一實(shí)驗(yàn)組比，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其抑制產(chǎn)酸作用都隨濃度的增加而加強(qiáng)；1∕2MIC沒食子酸與1∕4MIC鞣花酸對(duì)變形鏈球菌產(chǎn)酸的抑制效果相同（△pH=0.84）；1∕16MIC沒食子酸、1∕16MIC五倍子酸甲酯和1∕16MIC鞣花酸對(duì)變形鏈球菌和粘性放線菌的抗酸效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；總體來說，兒茶素對(duì)變形鏈球菌和粘性放線菌的抗酸效果優(yōu)于其余各實(shí)驗(yàn)組。

表2 紫地榆活性成分對(duì)變形鏈球菌和粘性放線菌產(chǎn)酸的影響（，n=6）

表2 紫地榆活性成分對(duì)變形鏈球菌和粘性放線菌產(chǎn)酸的影響（，n=6）

注：a.與陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；b.與陽性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；c.任意兩實(shí)驗(yàn)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

組別 濃度∕(g∕L)變形鏈球菌ΔpH 粘性放線菌ΔpH陰性對(duì)照組陽性對(duì)照組2.5900±0.0483 0.4400±0.0354 0.9600±0.0248abc 1.1700±0.0539ab 2.1900±0.0472ab 2.4000±0.0703ab 0.8300±0.0339ab 1.5900±0.0496abc 2.1700±0.0845ab 2.4500±0.0593ab 0.5000±0.0418ac 1.1900±0.0616ab 1.9300±0.0573abc 2.2500±0.0573abc 0.8000±0.0358ab 1.4900±0.0407abc 2.2000±0.0757ab 2.4100±0.0631ab沒食子酸■■■五倍子酸甲酯■■■■■■■■■兒茶素■■■■■■■■■鞣花酸■■■■■■■■■■■■■■■12MIC 14MIC 18MIC 116MIC 12MIC 14MIC 18MIC 116MIC 12MIC 14MIC 18MIC 116MIC 12MIC 14MIC 18MIC 116MIC 2.6700±0.0306 0.5500±0.0323 0.8400±0.0323ab 1.1000±0.0524abc 2.1500±0.0451ab 2.4600±0.0303ab 0.7000±0.0417ab 1.0200±0.0546abc 2.1300±0.0585ab 2.4000±0.0868abc 0.5200±0.0392ac 1.2000±0.0582abc 1.7200±0.0615abc 2.5000±0.0562abc 0.6800±0.0290ab 0.8400±0.0483ab 2.0900±0.0561ab 2.3100±0.0509ab

4 討論

本實(shí)驗(yàn)選用的是能產(chǎn)酸、使菌斑pH降到5以下的變形鏈球菌和粘性放線菌這2種口腔常駐細(xì)菌〔15〕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫地榆活性成分對(duì)這2種口腔常見菌均有顯著的產(chǎn)酸抑制作用（P＜0.05）。

實(shí)驗(yàn)中所用的醋酸洗必泰（CA）是能減少牙周病和齲病發(fā)生的一種廣譜抗生素〔16〕。臨床上首選0.05%的醋酸洗必泰漱口水治療各型口腔疾病，故本實(shí)驗(yàn)選用0.05%醋酸洗必泰作為陽性對(duì)照組。

綜上所述，紫地榆活性成分可以抑制致齲菌的產(chǎn)酸，對(duì)口腔致齲菌具有抑制作用。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在抑菌和殺菌方面，兒茶素、鞣花酸效果較好；在抑制細(xì)菌產(chǎn)酸方面，紫地榆活性成分均有效果。由此，可以考慮將紫地榆開發(fā)成牙膏、漱口水等產(chǎn)品用于口腔防齲。

〔1〕岳松齡.脫礦與再礦化：病變的主線 齲病學(xué)研究百年回顧與展望之七〔J〕.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2008，18（1）：1-8.

〔2〕李龍星，郭利軍，藍(lán)海.紫地榆對(duì)口腔致齲菌抑制作用的研究〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（36）：20600.

〔3〕戴啊師，蔡春木，藍(lán)海，等.天然藥物隔山消促進(jìn)釉質(zhì)再礦化的研究〔J〕.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2007，17（11）：635-637.

〔4〕藍(lán)海，王毅.紫地榆對(duì)人工脫礦釉質(zhì)再礦化效果的顯微硬度觀察〔J〕.中成藥，2012，34（12）：2424-2426.

〔5〕藍(lán)海，楊穎，楊曉莉，等.隔山消水提物對(duì)再礦化及抗酸脫礦作用的體外研究〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（24）：3639-3641.

〔6〕刁水全，陳娜，李翔，等.隔山消與氟化鈉對(duì)牛切牙脫礦的動(dòng)力學(xué)研究〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，9（8）：12-14.

〔7〕藍(lán)海，羅常輝.隔山消和五倍子水提物對(duì)牛切牙脫礦與再礦化的動(dòng)力學(xué)研究〔J〕.中成藥，2011，33（4）：692-694.

〔8〕藍(lán)海，張星星.天然藥物紫地榆不同溶劑提取物對(duì)牛切牙脫礦的動(dòng)力學(xué)研究〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（32）：18124-18125.

〔9〕楊曉莉，王芳芹，張俊，等.紫地榆不同溶劑提取物對(duì)防齲活性部位的研究〔J〕.中成藥，2014，36（10）：2074-2078.

〔10〕王麗梅，周學(xué)靈，布正興，等.紫地榆牙膏對(duì)牙釉質(zhì)脫礦和再礦化作用的研究〔J〕.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（10）：15-18.

〔11〕楊淋，王濤，藍(lán)海.紫地榆的乙酸乙酯部分和水部分抗粘性放線菌的體外研究〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，14（4）：8-11.

〔12〕楊淋，藍(lán)海.紫地榆兩種不同溶劑萃取物對(duì)變異鏈球菌的體外實(shí)驗(yàn)〔J〕.中成藥，2015，37（8）：1843-1845.

〔13〕廖先旻，寶福凱，程永現(xiàn)，等.中藥五倍子酚性與非酚性物質(zhì)抗變形鏈球菌和放線菌的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，39（1）：72-74.

〔14〕劉學(xué)軍，姜新亞，張玲玲.葡萄籽原花青素對(duì)粘性放線菌影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（6）：761-764.

〔15〕劉天佳.口腔疾病的微生物學(xué)基礎(chǔ)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1999：43.

〔16〕馬鴿，倪根珊.洗必泰的臨床應(yīng)用〔J〕.醫(yī)學(xué)導(dǎo)報(bào)，1994，13（3）：119-120.