紫地榆活性成分對致齲菌生長和產酸影響的體外研究

王麗梅，楊曉珍，藍 海*

（1.大理白族自治州人民醫院口腔科，云南大理 671000；2.大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000）

齲病是在多因素影響下的牙齒硬組織發生的慢性疾病。其中致齲菌產酸可導致羥基磷灰石晶體溶解，無機鈣、磷離子移出等，因此致齲菌產酸是釉質脫礦、發生齲損的主要原因。齲病表現為無機質的脫礦和有機質的分解，病變過程是一個脫礦與再礦化交替進行的過程〔1〕。紫地榆（Geranium strictipesR.Knuth）是牻牛兒苗科老鸛草屬植物，其根入藥，能消積食。有文獻報道，紫地榆提取物能抑制牙釉質脫礦并能促進牙釉質再礦化〔2-8〕。紫地榆的乙酸乙酯提取物和水提物均能有效抑制口腔中變形鏈球菌和血鏈球菌的生長和產酸〔9-11〕。本文旨在研究紫地榆活性成分對常駐口腔細菌的生長及產酸的影響。

1 材料

變形鏈球菌（批號：ATCC25175）、粘性放線菌（批號：ATCC27044）菌種購于廣東微生物菌種保藏中心；TPY液體培養基購于青島海博生物技術有限公司；沒食子酸，五倍子酸甲酯，兒茶素，鞣花酸，0.05%醋酸洗必泰（chlorhexidine acetate，CA），0.5、0.1 mol∕L氫氧化鈉，葡萄糖，蔗糖，0.5 mol∕L磷酸鹽緩沖液（PBS），無水乙醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，三氯甲烷，以上試劑均為分析純。

2 方法

2.1 實驗溶液的制備 將紫地榆的4種活性成分溶于TPY液體培養基中，使其最終濃度為16.000 g∕L，使用時按2倍稀釋法〔12〕稀釋。

2.2 菌液的制備 將細菌復蘇48 h后接種于TPY液體培養基中于厭氧條件下（37℃，80%N2、20%CO2）培養18 h進行增菌。經鑒定為純培養后，離心，取菌體用無菌生理鹽水洗滌3次。調整2種細菌的菌懸液濃度約5×107CFU∕mL。

2.3 2種致齲菌最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）的測定 配制含有紫地榆活性成分的液體培養基，按2倍稀釋法調整活性成分的濃度在0.125 g∕L至16.000 g∕L。在培養皿中接種細菌，菌懸液：含活性成分的培養基=1：1（V∕V），厭氧培養48 h。結果以肉眼觀察無菌生長的紫地榆活性成分濃度確定為該活性成分對該細菌的最低抑菌濃度。選擇大于最低抑菌濃度的各孔，取20 μL涂布于固體培養基上，肉眼觀察菌落數少于5～6個的紫地榆活性成分濃度為最低殺菌濃度。

2.4 紫地榆活性成分對2種口腔常駐細菌產酸能力影響的測定 根據“2.3”項下的測定結果，將含活性成分的液體培養基配成最低抑菌濃度以下4個濃度梯度，陽性對照組為0.05%醋酸洗必泰，陰性對照組為不含藥物的空白組，共6組，每組設3個平行管。將初始pH值調為7.4，菌懸液：含活性成分的培養基=1：1（V∕V），厭氧培養48 h。用pH計測定上清液的pH值并計算其pH的變化值△pH〔13-14〕。

2.5 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行處理，數據以（）表示，采用單因素方差分析比較各組總體均數，用Dunnett T3檢驗進行數據間兩兩比較，α=0.05。

3 結果

3.1 紫地榆活性成分對2種口腔常駐細菌生長的影響 從表1可以看出，紫地榆活性成分對變形鏈球菌和粘性放線菌均有生長抑制和殺菌作用。

表1 紫地榆活性成分對2種口腔常駐細菌的MIC和MBC值（g∕L）

3.2 紫地榆活性成分對2種口腔常駐細菌產酸作用的影響 由表2可見各濃度實驗組與空白對照組相比均具有抑制產酸的作用，差異均具有統計學意義（P＜0.05），并且隨著濃度升高，其抑制產酸作用逐漸增強；1∕2MIC兒茶素組對變形鏈球菌和粘性放線菌的產酸抑制效果與陽性對照組相近，差異無統計學意義（P＞0.05）；其余實驗組的產酸抑制效果均不如陽性對照組（P＜0.05）；不同濃度的同一實驗組比，組間差異均具有統計學意義（P＜0.05），其抑制產酸作用都隨濃度的增加而加強；1∕2MIC沒食子酸與1∕4MIC鞣花酸對變形鏈球菌產酸的抑制效果相同（△pH=0.84）；1∕16MIC沒食子酸、1∕16MIC五倍子酸甲酯和1∕16MIC鞣花酸對變形鏈球菌和粘性放線菌的抗酸效果差異無統計學意義（P＞0.05）；總體來說，兒茶素對變形鏈球菌和粘性放線菌的抗酸效果優于其余各實驗組。

表2 紫地榆活性成分對變形鏈球菌和粘性放線菌產酸的影響（，n=6）

表2 紫地榆活性成分對變形鏈球菌和粘性放線菌產酸的影響（，n=6）

注：a.與陰性對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；b.與陽性對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；c.任意兩實驗組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

組別 濃度∕(g∕L)變形鏈球菌ΔpH 粘性放線菌ΔpH陰性對照組陽性對照組2.5900±0.0483 0.4400±0.0354 0.9600±0.0248abc 1.1700±0.0539ab 2.1900±0.0472ab 2.4000±0.0703ab 0.8300±0.0339ab 1.5900±0.0496abc 2.1700±0.0845ab 2.4500±0.0593ab 0.5000±0.0418ac 1.1900±0.0616ab 1.9300±0.0573abc 2.2500±0.0573abc 0.8000±0.0358ab 1.4900±0.0407abc 2.2000±0.0757ab 2.4100±0.0631ab沒食子酸■■■五倍子酸甲酯■■■■■■■■■兒茶素■■■■■■■■■鞣花酸■■■■■■■■■■■■■■■12MIC 14MIC 18MIC 116MIC 12MIC 14MIC 18MIC 116MIC 12MIC 14MIC 18MIC 116MIC 12MIC 14MIC 18MIC 116MIC 2.6700±0.0306 0.5500±0.0323 0.8400±0.0323ab 1.1000±0.0524abc 2.1500±0.0451ab 2.4600±0.0303ab 0.7000±0.0417ab 1.0200±0.0546abc 2.1300±0.0585ab 2.4000±0.0868abc 0.5200±0.0392ac 1.2000±0.0582abc 1.7200±0.0615abc 2.5000±0.0562abc 0.6800±0.0290ab 0.8400±0.0483ab 2.0900±0.0561ab 2.3100±0.0509ab

4 討論

本實驗選用的是能產酸、使菌斑pH降到5以下的變形鏈球菌和粘性放線菌這2種口腔常駐細菌〔15〕。實驗結果顯示，紫地榆活性成分對這2種口腔常見菌均有顯著的產酸抑制作用（P＜0.05）。

實驗中所用的醋酸洗必泰（CA）是能減少牙周病和齲病發生的一種廣譜抗生素〔16〕。臨床上首選0.05%的醋酸洗必泰漱口水治療各型口腔疾病，故本實驗選用0.05%醋酸洗必泰作為陽性對照組。

綜上所述，紫地榆活性成分可以抑制致齲菌的產酸，對口腔致齲菌具有抑制作用。由實驗結果可以看出，在抑菌和殺菌方面，兒茶素、鞣花酸效果較好；在抑制細菌產酸方面，紫地榆活性成分均有效果。由此，可以考慮將紫地榆開發成牙膏、漱口水等產品用于口腔防齲。

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