雷帕霉素調劑對神經內分泌腫瘤組織中Caspase-9和Ki-67表達水平的影響

鄧海華 馬國祥 丁西萍 楊振漢

深圳市寶安區福永人民醫院內科，廣東 深圳 518103

神經內分泌腫瘤屬于神經系統腫瘤之一，該疾病嚴重威脅患者的生命安全[1-2]。雷帕霉素是臨床常用的化療藥物之一，然而，雷帕霉素治療神經內分泌腫瘤的分子機制尚有待進一步探討[3]。Caspase-9和Ki-67在神經內分泌瘤的發生，發展和預后中具有重要作用。Ki-67(nuclear-associated antigen，Ki-67)是細胞內與細胞增殖密切相關的蛋白分子[4]。在腫瘤細胞中，Ki-67的表達水平顯著高于非腫瘤細胞。Caspase-9是細胞凋亡的重要分子，在細胞凋亡的執行過程中發揮關鍵作用[5-6]。在腫瘤細胞中，細胞凋亡被抑制，Caspase-9的水平和活性也被抑制[7-8]。然而，Caspase-9和Ki-67在不同發展階段神經內分泌腫瘤細胞中的水平尚需進一步探討[9]。

1 實驗試劑和方法

1.1實驗試劑DAB酶底物顯色試劑盒購自北京鼎國生物技術股份有限公司。小鼠抗人Caspase-9多克隆抗體和小鼠抗人Ki67多克隆抗體都購自于美國Sigma生物技術有限公司。S-P免疫組化試劑盒購買于上海生物工程有限責任公司。其他試劑均購自碧云天生物技術研究所。

1.2研究病例本實驗中的488例神經內分泌腫瘤患者都來源于深圳市寶安區福永人民醫院腫瘤科自2013-07—2016-09接受手術治療的患者，發病部位為胃、腸、胰腺消化系統神經內分泌腫瘤。488例神經內分泌腫瘤患者被隨機分為對照組(未使用雷帕霉素244例)和雷帕霉素干預組(244例)。488例神經內分泌腫瘤患者，女264例，男224例，年齡18～70歲，平均46.6歲。按照2016年世界衛生組織對神經內分泌腫瘤的分級標準，患者分為6級[12]，其中1級56例，2級72例，3級128例，4級80例，5級80例，6級72例。治療方法是雷帕霉素的靶向藥物治療。所有病例的入選標準和排除標準都按照文獻報道的方法[10-11]進行，同時經病理學驗證和確診。本研究經深圳市寶安區福永人民醫院倫理委員會的批準，神經內分泌腫瘤患者均簽署了知情同意書。

1.3免疫組化的檢測方法采用SP染色法對神經內分泌腫瘤組織和對照組織進行免疫組化分析[13-14]。

1.4免疫組化陽性結果的認定免疫組化陽性結果的判定由3由經驗豐富的三位病理學專家獨立進行[15-16]。判定標準如下：沒有被染色定為0分，染色為淡黃色為1分，染色為棕黃色為2分，染色為棕褐色為3分。陽性細胞的定義：51%～75%的細胞陽性為4分，75%～90%的細胞陽性為5分，>90%的細胞陽性為6分。

1.5免疫印跡Western blot方法按照文獻報道[17]的方法進行免疫印跡實驗。首先，采集神經內分泌腫瘤患者的腫瘤組織及對照組織，使用組織裂解液裂解組織，制備組織蛋白樣品，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束進行轉膜，分別孵育抗Caspase-9和Ki-67的一抗，洗滌后再孵育二抗，最后進行顯影，定影。使用BandScan 軟件對電泳結果進行灰度值分析[18-20]。Caspase-9和Ki-67蛋白的灰度值比上內參β-actin的灰度值，分別作為Caspase-9和Ki-67的蛋白相對表達量。

1.6統計處理方法本文數據使用SPSS 13.0軟件分析。在相關性分析中，使用Spearman進行。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Ki-67在不同發展階段神經內分泌腫瘤組織中的表達水平和分布Ki-67在不同發展階段神經內分泌腫瘤組織中的表達水平和分布的分析結果如圖1所示：神經內分泌腫瘤組織的免疫組化染色的陽性染色呈棕紫色或紫色，為顆粒狀分布，Ki-67在神經內分泌腫瘤中上皮細胞的細胞核中具有顯著的表達和分布(見表1～2)。

表1 Ki-67在不同發展階段的各級神經內分泌腫瘤組織中的表達

表2 Ki-67在不同程度分級中的表達情況

2.2 Caspase-9在神經內分泌腫瘤組織的免疫組化染色的陽性染色和分析結果Caspase-9在不同發展階段神經內分泌腫瘤組織中的表達水平和分布的分析結果如下(如圖2所示)：神經內分泌腫瘤組織的免疫組化染色的陽性染色呈紅色或紫紅色，為顆粒狀分布，Caspase-9在神經內分泌腫瘤中上皮細胞的細胞核和細胞質中具有顯著的表達和分布。從1級到6級的分級中，神經內分泌腫瘤患者中Caspase-9陽性表達率依次分別為70.5%，65.7%，67.8%，41.2%，18.8%和10.1%，組間各級別的差異具有統計學意義(P<0.05)(χ2=10.3)(見表3～4)。

圖1 Ki-67在不同發展階段神經內分泌腫瘤組織中的表達水平和分布的分析結果 神經內分泌腫瘤組織的免疫組化染色的陽性染色和分析結果，染色呈棕紫色或紫色 圖2 神經內分泌腫瘤組織的免疫組化染色的陽性染色和分析結果 神經內分泌腫瘤組織的免疫組化染色的陽性染色和分析結果，染色呈棕紫色或紫色

表3 Caspase-9在神經內分泌腫瘤組織的免疫組化染色的陽性染色和分析結果 [n(%)]

表4 Caspase-9在不同程度腫瘤分級中的表達 (n)

2.3神經內分泌腫瘤組織中Caspase-9和Ki-67表達水平的相關性分析結果本研究分析了Caspase-9和Ki-67表達水平的相關性，結果提示，在低分化階段的神經內分泌腫瘤組織中，Caspase-9和Ki-67表達水平的相關系數無統計學意義(表5)。在中高分級的級階段神經內分泌腫瘤組織中，Caspase-9和Ki-67表達水平的相關系數具有統計學意義(見表5～6)。

2.4神經內分泌腫瘤組織中Caspase-9和Ki-67表達的結果本研究使用western blot檢測了神經內分泌癌旁組織和腫瘤組織中Caspase-9和Ki-67的表達水平。圖3中結果顯示，神經內分泌腫瘤組織中Ki-67的蛋白表達水平高于癌旁組織，差異具有顯著性。圖4中結果顯示，神經內分泌腫瘤組織中Caspase-9的蛋白表達水平高于癌旁組織，差異具有顯著性。

表5 神經內分泌腫瘤組織中Caspase-9和Ki-67表達水平的相關性分析結果 (n)

表6 Caspase-9和Ki-67在中高級分化階段神經內分泌腫瘤組織中表達水平的關系 (n)

圖3 神經內分泌腫瘤組織中Ki-67表達的結果注：A是Ki-67表達的western blot結果，B是三次不同實驗的統計學結果圖4 神經內分泌腫瘤組織中Caspase-9表達的結果注：A是Caspase-9表達水平的western blot的分析結果，B是三次不同實驗的統計學結果

2.5經雷帕霉素治療后，神經內分泌腫瘤組織中Caspase-9的表達水平的結果圖5～6中數據顯示，神經內分泌腫瘤患者經雷帕霉素治療后，Caspase-9的表達水平顯著上升，Ki-67的表達水平顯著下降，與未經雷帕霉素治療組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，這暗示，雷帕霉素可能是通過引起腫瘤細胞發生凋亡而發揮其抗腫瘤作用的。

圖5 雷帕霉素治療后神經內分泌腫瘤組織中Ki-67表達水平的結果 圖6 雷帕霉素治療后神經內分泌腫瘤組織中Caspase-9表達水平的結果

3 討論

神經內分泌腫瘤是神經系統重要的腫瘤之一，隨著老齡社會的到來，神經內分泌腫瘤的發病率及病死率都出現增加的趨勢，該疾病嚴重威脅著患者的生命[21-22]。Caspase-9和Ki-67在神經內分泌瘤的發生，發展和預后中具有重要作用[23]。雷帕霉素是臨床上治療腫瘤的一線藥物之一，而其在神經內分泌腫瘤中的治療機制尚有待進一步探討[24]。

本研究主要結果如下：(1)免疫組織化學的結果表明，神經內分泌腫瘤患者不同分化情況如下：從1級到6級的分級中，神經內分泌腫瘤患者中Caspase-9陽性表達率依次分別為70.5%，65.7%，67.8%，41.2%，18.8%和10.1%，組間各級別的差異具有統計學意義(P<0.05)。神經內分泌腫瘤患者中Ki-67陽性表達率依次分別為13.3%，21.2%，36.5%，58.8%，68.8%和76.8%，組間各級別差異具有統計學意義(P<0.05)。這與以往的研究結果是高度相符[25-26]，即腫瘤細胞增殖速度增加，細胞凋亡被抑制。(2)Caspase-9和Ki-67的表達水平之間具有明顯的相關性(P<0.05)。(3)經雷帕霉素治療后，Caspase-9的表達水平顯著上升，Ki-67的表達水平顯著下降，與未經雷帕霉素治療組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。這更支持了前人的研究[27-28]，即雷帕霉素發揮抗腫瘤作用主要是通過抑制細胞增殖及促進細胞凋亡實現的。這些結果表明，在神經內分泌腫瘤的進展過程中，Caspase-9的表達水平降低，Ki-67的表達水平增加，提示神經內分泌腫瘤細胞增殖加速，凋亡減少。經雷帕霉素治療后，Caspase-9的表達水平增加，Ki-67的表達水平降低，這表明，雷帕霉素可能通過調節Caspase-9和Ki-67的表達水平而發揮其抗腫瘤作用。

本文尚有不足之處，具體表現如下：(1)本研究中的臨床患者病例僅有488個，結果尚需要進一步驗證。(2)本研究缺少雷帕霉素是如何調節Caspase-9和Ki-67表達水平的。(3)本研究缺少神經內分泌腫瘤大鼠或小鼠的動物模型，使用敲低或過表達Caspase-9和Ki-67進一步研究其表達水平與神經內分泌腫瘤的關系。

總之，本文數據提示，在神經內分泌腫瘤的進展過程中，Caspase-9的表達水平降低，Ki-67的表達水平增加，提示神經內分泌腫瘤細胞增殖加速，凋亡減少。經雷帕霉素治療后，Caspase-9的表達水平增加，Ki-67的表達水平降低，這表明雷帕霉素可能通過調節Caspase-9和Ki-67的表達水平而發揮其抗腫瘤作用。本研究數據還提示，Caspase-9和Ki-67可能是神經內分泌腫瘤患者檢測和預后的可能的分子標記物。

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