血清let-7家族水平和大面積腦梗死的嚴重程度的相關性研究

洪有波

急性缺血性腦卒中涉及頸動脈或大腦中動脈(MCA)整個血管分布區域可引起大面積腦梗死(MCI)[1]，其短期和長期預后均較差，導致大多數患者死亡，即使生存也會遺留嚴重的神經功能損傷[2-4]。在所有MCA病變導致的腦梗死中MCI占10%～15%[5]。微小RNA(miRNA)是一組單鏈的非編碼的RNAs，調節各種病理生理過程包括腫瘤發生、細胞增殖、造血、代謝、炎癥、胚胎形成等[6-8]。let-7家族是在秀麗隱桿線蟲中發現的第2個miRNA家族。后來的研究發現它具有重要的調控作用如細胞生長、分化和凋亡[9-11]。let-7表達異常與許多人類疾病如癌癥和心血管疾病密切相關[12-13]。根據微陣列測定的結果，let-7家族在急性缺血性腦卒中患者體內表達異常[14-15]。慢性炎癥一直被廣泛認為在動脈粥樣硬化形成過程中發揮重要作用[16]，并且炎癥標志物(例如IL-6)的水平與腦血管事件的風險存在一定的相關性[17-18]。本研究旨在評估急性大面積腦梗死(MCI)患者血清let-7家族水平與MCI嚴重程度的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月-2017年6月在本院神經內科接受治療的MCI患者88例。納入標準：(1)年齡>18歲;(2)腦卒中48 h內入院;(3)根據CT或MRI表現，患者梗死面積占至少67%的MCA的分布區域[19]。排除標準如下：(1)患者由于代謝紊亂或藥物治療失去意識;(2)患者接受了任何鎮靜藥物或手術治療;(3)改良Rankin量表(mRS)的腦卒中術前評分>2; (4)合并可能影響患者臨床結局的并發癥如嚴重的心肺疾病。選取健康受試者(健康對照組，n=45)，患有缺血性腦卒中而無MCI(IS無MCI組，n=40)和出血性腦卒中(ICH組，n=45)的患者作為對照組。對于沒有嚴重心肺并發癥的MCI患者，在發病2周后再次進行CT檢查，確定發生出血性轉化(HT)(n=22)和不存在HT(n=34)。

1.2 樣本采集

采集靜脈血5 mL，4℃，200 r/min×離心15 min，去除上清液在-80℃保存待測。

1.3 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(real time qRT-PCR)

采用逆轉錄系統和Gotaq qPCR Master Mix(Promega)進行real time qRT-PCR。使用5s核糖體RNA(5s rRNA)作為標準化樣品。按照試劑盒說明書使用LightCycler 1.5實時PCR系統(Roche)進行操作。采用比較周期閾值方法(Ct)進行qRT-PCR數據的比較?；虮磉_的相對變化使用Livak方法(也稱為2-ΔΔCt方法)確定。所有反應重復進行3次。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 2組患者的一般臨床特征比較

在MCI組(48 h)、IS無MCI組，ICH組和健康對照組之間年齡和性別無明顯差異(P均>0.05)(表1)。在MCI患者人群中發生出血性轉化(HT)(n=22)和不存在HT的患者之間的年齡和性別沒有明顯差異(P均>0.05)(表2)。

表1 入院48 h內各組患者的年齡和性別比較)

表2 入院2周后MCI組內患者的年齡和性別比較)

2.2 實時qRT-PCR檢測48 h各組Let-7家族mRNA表達水平

為了證實由微陣列鑒定的基因表達的變化，8種miRNA(let-7a，let-7b，let-7c，let-7d，let-7e，let-7f，let-7g，miR-98)被選擇用于實時qRT-PCR的分析。(1)MCI組let-7c(0.123±0.072)和let-7f(1.188×10-2±0.737×10-2)相對表達水平顯著降低；(2)IS無MCI組的let-7b(7.382±1.112)，let-7c(34.226±4.642)，let-7d(7.214±1.321)和let-7f(17.852±2.656)的相對表達水平明顯增加；(3)ICH組的let-7f(40.251±3.572)的相對表達水平明顯增加；(4)與IS無MCI和ICH組比較，MCI和健康對照組的let-7f的相對表達水平明顯降低(P<0.001)(圖1)。

2.3 實時qRT-PCR檢測2周各組Let-7家族mRNA表達水平

(1)與MCI無HT(48 h)患者人群比較(1.188×10-2±0.737×10-2)，MCI無HT(2周)患者人群的let-7f(0.145±0.092)相對表達水平明顯升高(P<0.01)；(2)與MCI無HT(2周)患者人群比較，MCI合并HT(2周)患者人群的let-7f(40.668±4.601)相對表達水平明顯升高(P<0.01)。另外，在MCI無HT(48 h)和(2周)組let-7f相對表達水平與GCS正相關(r=0.639，P<0.01)(圖2)。

2.4 Let-7f表達水平與hs-CRP的相關性

腦卒中的常規危險因素包括收縮壓、舒張壓、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯、空腹血糖水平、同型半胱氨酸和hs-CRP水平在MCI和IS無MCI組間無顯著性差異(表3)。另外，hs-CRP的水平與let-7f的相對表達水平呈負相關(r=-0.673,P<0.01)。

圖1 實時qRT-PCR檢測48 h各組Let-7家族mRNA表達水平 A為與健康對照組比較,MCI組let-7c和let-7f相對表達水平顯著降低(#P<0.01,*P<0.05);B為與健康對照組比較,IS無MCI組的let-7b、let-7c、let-7d以及let-7f的相對表達水平顯著增加(#P<0.01,*P<0.05);C為與健康對照組比較,ICH組的let-7f的相對表達水平顯著增加(#P<0.01);D為與IS無MCI和ICH組比較,MCI和健康對照組的let-7f的相對表達水平明顯降低(#P<0.01);與ICH組比較,*P<0.01

圖2 實時qRT-PCR檢測2周各組Let-7家族mRNA表達水平 A為與MCI無HT(48 h)患者人群比較,MCI無HT(2周)患者人群的let-7f相對表達水平明顯升高(*P<0.05);B為與MCI無HT(2周)患者人群相比較,MCI合并HT(2周)患者人群的let-7f相對表達水平明顯升高(*P<0.05)。

3 討 論

本研究結果顯示，與健康對照組和IS無MCI組患者比較，MCI患者的let-7f表達水平明顯降低。此外，在MCI組中let-7f表達水平與hs-CRP水平呈負相關。另外，在MCI無HT患者人群中let-7f水平隨著患者病情的改善而升高，與GCS呈正相關。

大量有關缺血性腦卒中的研究結果顯示，炎癥因子特別是IL-6影響繼發性損傷和恢復的過程[20]。由于腦梗死過程中的缺氧和缺血性損傷而超量產生的ROS誘導IL-6上調[21]。此外，IL-6是炎癥反應的早期和中樞性調控分子，通過引起內皮功能失調、平滑肌細胞增殖和遷移以及炎癥細胞的募集和激活來促進動脈粥樣硬化的發生發展[22]。作為IL-6的靶向分子，NF-κB作為轉錄因子促進iNOS的表達。iNOS在炎癥期間高度表達，并導致NO的產生增加，導致大腦受到氧化性損傷[23]。此外，作為IL-6的下游分子，STAT3的激活與ROS產生有關，可能進一步增加IL-6的生成量。有研究發現，抑制STAT3激活能夠減小局灶性腦缺血的梗死體積，減輕缺血/再灌注損傷。以前的研究表明，IL-6可能會造成缺血性腦卒中患者的神經功能障礙。除了IL-6外，其他的let-7f靶基因包括MYH9[24]、CYP19A1[25]、IGF-1R[13]、HMGB1[10]、胃蛋白酶原C[26]、IL-23R[27]、THBS1[28]、骨膜素[29]均參與了腦卒中的發生發展。

表3 MCI和IS無MCI組間腦卒中的常規危險因素的比較

大量體內和體外研究結果顯示，let-7能夠誘導神經元死亡，并且導致中樞神經系統損傷。最近的一項研究報道了炎癥信號刺激的調節通路導致NF-kB核轉位[30]。此外，本研究的實時qRT-PCR檢測結果顯示，與MCI無HT組(48 h)患者人群比較，MCI無HT組(2周)患者人群的let-7f相對表達水平明顯升高(P<0.01)；與MCI無HT組(2周)患者人群比較，MCI合并HT組(2周)患者人群的let-7f相對表達水平明顯升高(P<0.01)。出血、局部炎癥反應以及血管生成過程是HT的重要因素。O'Carroll等[31]發現促炎癥因子TNF-α和人腦微血管內皮細胞(hCMVECs)的IL-1β活化是參與血腦屏障損傷的重要免疫介質。

綜上所述，本研究發現與健康受試者、IS無MCI以及ICH患者比較，MCI無HT患者人群的Let-7f表達水平明顯降低。此外，與健康受試者比較，MCI合并HT患者的Let-7f表達水平明顯增加，這提示Let-7f可能參與了MCI過程中HT的發生發展。因為let-7f可以抑制IL-6的表達。因此，Let-7f在無HT的MCI患者中的水平降低可能會引起炎癥反應。

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