ApoE和Slco1B1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性分析

羅寶昌 張敬

腦卒中是指由于腦循環(huán)障礙所致的局部或全面性腦功能缺損綜合征，現(xiàn)已成為全球致死率及致殘率較高的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。腦卒中主要分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類，其中缺血性腦卒中患者占66.7%左右[2]。缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，不僅與大量的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素相關(guān)，而且基因多態(tài)性也嚴(yán)重影響缺血性腦卒中的發(fā)生[3-4]。

APOE基因位于染色體上以三種等位基因ε2、ε3和ε4形式存在，分別編碼三種不同的蛋白亞型E2、E3和E4[5]。三種蛋白亞型僅表現(xiàn)為112位和158位氨基酸的差異，從而導(dǎo)致脂質(zhì)親和力的差異而可能影響缺血性腦卒中發(fā)生[4]。APOE基因多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性目前尚未定論，部分學(xué)者認(rèn)為APOE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中具有相關(guān)性[6-7]，而部分學(xué)者認(rèn)為兩者之間無(wú)明顯相關(guān)性[8-10]。地區(qū)和種族可能是影響結(jié)果的一個(gè)因素，而漢川市漢族人群APOE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的發(fā)生是否相關(guān)，尚未見相關(guān)報(bào)道。

Slco1B1基因位于染色體上，具有高度遺傳多態(tài)性，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)40個(gè)以上的非同義單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。他汀類藥物如匹伐他汀、新伐他汀、普伐他汀等是治療缺血性腦卒中的常見藥物。研究發(fā)現(xiàn)Slco1B1基因位點(diǎn)rs4149056(521T>C)多態(tài)性影響他汀類藥物的吸收，從而對(duì)療效產(chǎn)生影響[11-12]。而Slco1B1基因位點(diǎn)rs4149056多態(tài)性與缺血性腦卒中的發(fā)生是否相關(guān)，尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究通過(guò)直接測(cè)序法分析缺血性腦卒中患者和健康對(duì)照人群ApoE基因型及Slco1B1 rs4149056位點(diǎn)基因型，從而進(jìn)一步研究ApoE基因和Slco1B1多態(tài)性與漢川市漢族人群缺血性腦卒中的相關(guān)性，為揭示缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制及缺血性腦卒中的預(yù)防及治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料及納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

選取2015年6月-2017年6月本院收治450例缺血性腦卒中患者為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)選取同期于本院體檢的450例正常人為對(duì)照組，研究對(duì)象均來(lái)自漢川市漢族人群。納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷參考全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)腦CT或MRT檢查證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重感染、肝腎功能異常、惡性腫瘤、甲狀腺和血液系統(tǒng)疾病等患者。

1.2 基因組DNA提取

清晨收集受試者空腹外周靜脈血2 mL，加入抗凝劑后混勻。根據(jù)OMEGA公司試劑盒Blood DNA kit說(shuō)明書提取基因組DNA后-20 ℃保存。

1.3 克隆及測(cè)序

根據(jù)Qiagen公司Hotstar Taq Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)(引物序列見表1)。PCR反應(yīng)體系為總體積25 μL，其中模板6 μL(約100 ng)，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，去離子水4.5 μL。 PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min， 95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR情況，選擇陽(yáng)性克隆送至華大基因進(jìn)行測(cè)序，GeneMapper軟件用于基因分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較

2組性別、年齡、身高、體重均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表1 PCR引物列表

表2 一般資料比較

2.2 ApoE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性

對(duì)照組基因型頻率都符合Hardy-weinberg平衡(P=0.982)(表3)。基因型分析發(fā)現(xiàn)2組中均含有ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4和ε4/ε4 6種基因型，2組基因型有顯著性差異(P=0.034)(表4)。與ε3/ε3基因型比較，ε2/ε4、ε3/ε4和ε4/ε4基因型可能更易患缺血性腦卒中，分別為OR=3.219，95%CI=1.156～8.963；OR=1.391，95%CI=0.969～1.998和OR=3.219，95%CI=0.645～16.069。

2.3 Slco1B1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性

對(duì)照組基因型頻率都符合Hardy-weinberg平衡(P=0.469)(表5)。對(duì)照組T>C突變頻率為11%，而實(shí)驗(yàn)組突變頻率則達(dá)到15.2%，2組基因型有顯著性差異(P=0.031)(表6)。與TT基因型比較，TC和CC基因型可能更易患缺血性腦卒中，分別為OR=1.290，95%CI=0.929～1.790；和OR=2.568，95%CI=1.109～5.945。

表3 對(duì)照組ApoE基因型Hardy-weinberg平衡

表4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組ApoE基因型分布

表5 對(duì)照組Slco1B1基因型Hardy-weinberg平衡

表6 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Slco1B1基因型分布

3 討 論

載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是一種富含精氨酸的堿性蛋白，可通過(guò)調(diào)節(jié)膽固醇及脂類物質(zhì)的存儲(chǔ)和再分布影響血漿蛋白代謝，同時(shí)參與組織修復(fù)、抑制血小板聚集等生理過(guò)程，并在神經(jīng)系統(tǒng)的正常生長(zhǎng)過(guò)程中及損傷后的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用[13]。截至目前，APOE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性研究很多，但結(jié)論具有一些分歧[6-10]。本研究結(jié)果表明，漢川市漢族人群APOE基因多態(tài)性可能與缺血性腦卒中相關(guān)，ε2/ε4、ε3/ε4和ε4/ε4基因型可能更易患缺血性腦卒中，這與部分學(xué)者研究結(jié)果一致[6-7]，但與Gu 等研究結(jié)果存在差異[8-10]。出現(xiàn)不同結(jié)果的原因可能是由于研究方法及納入群體的差異所致。例如Gu等發(fā)現(xiàn)廣西漢族APOE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中無(wú)關(guān)，而通過(guò)Meta分析又發(fā)現(xiàn)漢族APOE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中有關(guān)[8]。

Slco1B1基因編碼蛋白質(zhì)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(OATP1B1)，陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(OATP1B1)是一種特異性表達(dá)于肝細(xì)胞基底膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，介導(dǎo)多種內(nèi)源性或外源性物質(zhì)從血液向肝細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[14-15]。SLCO1B1 rs4149056是常見的具有功能意義的SNP位點(diǎn)，其在不同種族人群中的分布存在很大的差異，在高加索人、非洲人和亞洲人中突變概率分別為15%～20%，1%～2%和10%～15%[16-18]。本研究對(duì)照組rs4149056突變頻率為11%，而實(shí)驗(yàn)組突變頻率為15.2%，這均與已報(bào)到的亞洲人群突變頻率報(bào)道接近[18]。本研究發(fā)現(xiàn)Slco1B1基因rs4149056位點(diǎn)多態(tài)性可能與缺血性腦卒中有關(guān)，TC和CC基因型可能更易患缺血性腦卒中，等位基因C可能是腦卒中易感基因。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組APOE基因型和Slco1B1基因型都符合Hardy -weinberg平衡，這表明抽樣具有代表性，適合于后續(xù)遺傳分析(P=0.982和P=0.469)。通過(guò)病例-對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，漢川市漢族人群APOE基因多態(tài)性及Slco1B1基因rs4149056位點(diǎn)多態(tài)性可能與缺血性腦卒中有關(guān)。

本研究具有一定的局限性。一部分是樣本數(shù)相對(duì)較少，可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，后期需擴(kuò)大樣本；另一部分是需多因素考慮，需排除個(gè)人生活習(xí)慣等造成的影響，后期需多因素綜合分析，從而得出更準(zhǔn)確的結(jié)論。

綜上所述，漢川市漢族人群APOE基因多態(tài)性及Slco1B1基因rs4149056位點(diǎn)多態(tài)性可能與缺血性腦卒中有關(guān)。后期需加大樣本量和多因素綜合分析來(lái)進(jìn)一步探索APOE基因多態(tài)性及Slco1B1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性。

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