腦梗死患者血漿胎盤生長(zhǎng)因子水平的變化及意義

劉歡 何國(guó)厚 張兆輝 艾志兵

腦梗死是由于動(dòng)脈粥樣硬化大動(dòng)脈疾病、小動(dòng)脈疾病(腔隙性腦梗死)或心臟栓塞等原因引起血管嚴(yán)重狹窄或閉塞，供血區(qū)腦組織發(fā)生缺血性壞死，進(jìn)而出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損的腦血管疾病。目前腦梗死的治療方法主要是通過藥物及血管內(nèi)治療使血管再通，盡早恢復(fù)缺血半暗帶的血液供應(yīng)，保護(hù)尚未壞死的神經(jīng)元，減輕腦水腫，從而有效降低腦梗死的致殘、致死率。PLGF是一種主要表達(dá)于胎盤中的血管生長(zhǎng)蛋白，在心肌缺血等病理狀態(tài)下其表達(dá)明顯上調(diào)，也可通過調(diào)節(jié)VEGF的活性間接發(fā)揮腦保護(hù)作用，因此也被認(rèn)為是一種很有潛力的治療缺血性疾病的血管生成因子[1]。目前對(duì)PLGF在腦梗死方面的研究十分有限，近年有研究發(fā)現(xiàn)PLGF與腦梗死患者預(yù)后有關(guān)[2]。但對(duì)于腦梗死后各時(shí)期及不同梗死面積PLGF水平的變化，國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過測(cè)定腦梗死患者血漿PLGF水平，來探討PLGF水平在腦梗死后不同時(shí)期和不同梗死面積中的變化及意義，從而為腦梗死診斷、病情嚴(yán)重程度及預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年2月-2017年7月在十堰市太和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的92例腦梗死患者(腦梗死組)及46例同期住院的非腦血管病患者(對(duì)照組)作為研究對(duì)象，腦梗死的診斷參照我國(guó)第四屆腦血管疾病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)顱腦CT和(或)MRI檢查進(jìn)一步證實(shí)。根據(jù)腦梗死發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)短將腦梗死組分為急性期組和恢復(fù)期組，規(guī)定急性期組發(fā)病時(shí)間為7 d內(nèi)，恢復(fù)期組為發(fā)病后7～30 d。采用顱腦CT或MRI測(cè)定所有腦梗死患者最大梗死直徑，根據(jù)直徑大小將腦梗死患者分為大面積梗死組(≥5 cm)、中面積梗死組(2～5 cm)和小面積梗死組(≤2 cm)。所有納入對(duì)象均簽署知情同意書并且需排除以下情況：既往有腦梗死和(或)腦出血病史、近3個(gè)月來頭部外傷史、嚴(yán)重的肝腎功能異常、血液系統(tǒng)疾病、全身系統(tǒng)感染、腫瘤、自身免疫性疾病、妊娠或哺乳期婦女。

1.2 方法

1.2.1 一般資料記錄 記錄所有研究對(duì)象的年齡、性別、吸煙史、高血壓病史、糖尿病史、冠心病史，入院后均行血常規(guī)、肝腎功能、凝血功能、血脂、血糖、HCY、hsCRP及顱腦CT和(或)MRI檢查。

1.2.2 標(biāo)本采集及PLGF水平測(cè)定 所有研究對(duì)象均在入院后第2 d清晨空腹抽取靜脈血4 mL，肝素鈉抗凝，并在標(biāo)本采集后30 min內(nèi)于4 ℃ 1 000 r/min離心15 min，然后取上清置于EP管內(nèi)，置于-80℃冰箱內(nèi)保存，避免反復(fù)凍融，待所有標(biāo)本采集完畢后進(jìn)行集中檢測(cè)。測(cè)定前將PLGF-ELISA試劑盒中所有試劑及標(biāo)本緩慢均衡至室溫(18～25℃)，并在操作前15 min配置好實(shí)驗(yàn)所需要的試劑。實(shí)驗(yàn)方法：加樣(標(biāo)準(zhǔn)品或樣本)100 uL，37 ℃孵育1 h；甩干，加檢測(cè)溶液A 100 uL，37 ℃孵育1 h；洗板3次；加檢測(cè)溶液B 100 uL，37 ℃孵育30 min；洗板5次；加TMB底物90 uL，37 ℃避光孵育10～20 min；加終止液50 uL，立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔光密度(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品水平。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死組和對(duì)照組一般資料比較

腦梗死組和對(duì)照組年齡、性別、吸煙史、高血壓病史、糖尿病史、冠心病病史、HDL及LDL水平比較均無明顯差異(P>0.05)；腦梗死組TC、TG、HCY、hsCRP、PLGF水平高于對(duì)照組(P<0.05)(表1)。

表1 腦梗死組和對(duì)照組患者一般資料比較

2.2 不同時(shí)期腦梗死患者血漿PLGF水平比較

腦梗死急性期組PLGF水平高于恢復(fù)期組，但無明顯差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同時(shí)期腦梗死患者血漿PLGF水平比較)

2.3 不同梗死面積腦梗死患者血漿PLGF水平比較

小面積梗死組血漿PLGF水平明顯低于中面積及大面積梗死組(P<0.05)；大面積梗死組血漿PLGF水平明顯高于中面積梗死組(P<0.05)(表3)。

3 討 論

VEGF是第1個(gè)被用于研究腦梗死的血管生長(zhǎng)因子，它不僅可促進(jìn)缺血腦組織的血管生成，減少梗死體積，還具有促進(jìn)神經(jīng)組織再生和神經(jīng)保護(hù)作用[3-4]。我國(guó)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)腦梗死組患者發(fā)病后第2、7及14 d血清VEGF水平均明顯高于對(duì)照組，說明VEGF可能參與了腦梗死的病理生理過程，且VEGF水平與腦梗死患者的病情輕重及預(yù)后密切相關(guān),腦損傷越重、梗死灶體積越大、預(yù)后較好,VEGF水平越高[5]。PLGF是由Maglione等人最早在胎盤cDNA庫(kù)中分離得到的與VEGF結(jié)構(gòu)高度相似的糖化二聚體蛋白，是CPA內(nèi)皮細(xì)胞的促分裂原[6-7]，能和Flt-1/VEGFR-1、神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1，NRP1)和神經(jīng)纖毛蛋白-2(neuropilin-1，NRP2)受體結(jié)合，但不能和Flk-1/VEGFR-2受體結(jié)合[7-9]。PLGF作為VEGF家族七大成員之一(還有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F)，對(duì)血管生長(zhǎng)有著不可忽視的作用，可刺激缺血心肌、肢體的血管發(fā)生和動(dòng)脈生成，刺激成熟非滲漏血管的形成[10]。有研究發(fā)現(xiàn)PLGF基因敲除小鼠在全身缺氧情況下腦血管生長(zhǎng)反應(yīng)延遲，生成的血管不穩(wěn)定，增加腦通透性[11]。Liu等通過MRI和組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PLGF誘導(dǎo)血管發(fā)生不會(huì)引起腦水腫[12]。另外，在受損心肌中也發(fā)現(xiàn)PLGF誘導(dǎo)血管生成可避免VEGF引起的一些副作用，如引起水腫、纖維蛋白原沉積、不穩(wěn)定血管結(jié)及腎小球樣小體的生成[13-14]。因此，PLGF比VEGF在治療缺血性疾病方面更具有優(yōu)勢(shì)，有望成為治療缺血性疾病的新型藥物。

表3 不同梗死面積腦梗死患者血漿PLGF水平比較)

注：與小面積梗死組比較，*P<0.05;與中面積梗死組比較，#P<0.05

本研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者血漿PLGF水平明顯高于對(duì)照組，說明PLGF可能參與了腦梗死的病理生理過程。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，在正常小鼠腦內(nèi)PLGF mRNA和蛋白質(zhì)遍及所有神經(jīng)元中，而血管和星形細(xì)胞中不能表達(dá)PLGF。在腦梗死發(fā)生后PLGF表達(dá)首先在缺血的神經(jīng)元中上調(diào)，在大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)后24 h達(dá)峰值，隨后逐漸下降，在MACO 3 d完全缺乏表達(dá)；PLGF mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)在梗死區(qū)及其周圍的血管內(nèi)(MCAO后3 d達(dá)峰值)、梗死區(qū)的巨噬細(xì)胞(MCAO后3～7 d)、缺血邊界區(qū)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞(僅PLGF蛋白)中也發(fā)生上調(diào)[15]。PLGF在大鼠CNS中表達(dá)，尤其在腦缺血后的腦微血管和間質(zhì)中，還參與到腦缺血過程中，PLGF釋放對(duì)糖氧剝奪受損神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用[16]。Liu等對(duì)永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠分別靜脈轉(zhuǎn)染人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)和過多分泌PLGF的hMSCs(PLGF-hMSCs)，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞類型均可誘導(dǎo)缺血腦組織內(nèi)PLGF水平升高，從而減少缺血腦組織體積，增加血管生成，改善受損的神經(jīng)功能，且PLGF-hMSC發(fā)揮的效應(yīng)更強(qiáng)，說明PLGF在腦梗死后可促進(jìn)血管生成、保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞[12]。PLGF促進(jìn)血管生成、營(yíng)養(yǎng)及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的可能機(jī)制如下[17-20]：①直接與Flt-1/VEGFR-1受體結(jié)合，刺激特異性酪氨酸殘基磷酸化和下游不同靶基因表達(dá)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及分化；②PLGF可以將VEGF從Flt-1/VEGFR-1中分離出來，使VEGF激活Flk/VEGFR-2發(fā)揮作用；③PLGF作為一種刺激劑，可增強(qiáng)VEGF與Flk/VEGFR-2結(jié)合后產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)；④招募對(duì)血管生長(zhǎng)至關(guān)重要的單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞；⑤動(dòng)員骨髓中的造血祖細(xì)胞；⑥NRP作為VEGF和PLGF的共同受體，在血管生成及神經(jīng)保護(hù)方面也具有重要作用，NRP-1增強(qiáng)了VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞趨化性以及VEGF與Flk/VEGFR-2的結(jié)合。Carmeliet等發(fā)現(xiàn)體內(nèi)缺乏PLGF會(huì)減少缺血肢體、炎癥及腫瘤等病理狀態(tài)下的血管新生、血管滲透性發(fā)生和側(cè)枝形成[21]。Luna也發(fā)現(xiàn)PLGF基因缺陷小鼠側(cè)支血管和Wills環(huán)前部血管數(shù)量明顯減少[22]，這提示PlGF還可通過促進(jìn)側(cè)支循環(huán)形成來參與腦梗死的病理生理過程。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究也發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死患者血漿PIGF水平顯著高于對(duì)照組，從臨床角度說明了PlGF與腦梗死可能具有相關(guān)性，且PlGF在不同病因腦梗死的發(fā)病機(jī)制中權(quán)重不同[23]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，腦梗死急性期組血漿PLGF水平明顯高于恢復(fù)期組，但卻沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明腦梗死患者血漿PLGF水平可能與病程無關(guān)。另外，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)規(guī)定急性期時(shí)間為發(fā)病7 d內(nèi)，所以也有可能是因?yàn)檠獫{PLGF水平在這7 d前已達(dá)高峰，隨后又逐漸下降，最終保持于和恢復(fù)期相當(dāng)?shù)乃剑斐勺罱K2組PLGF水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，后期我們還需對(duì)腦梗死患者PLGF水平進(jìn)行急性期多時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)，探討PLGF水平在急性期的動(dòng)態(tài)變化。本研究還進(jìn)一步分析了血漿PLGF水平與不同梗死面積的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)大、小、中梗死面積之間PLGF水平具有顯著差異，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PLGF可能還與腦梗死病情程度有關(guān)，即梗死面積越大，病情越重，PLGF水平越高。但本實(shí)驗(yàn)樣本量仍相對(duì)較少，以后還需大量的臨床試驗(yàn)證實(shí)結(jié)果的可靠性。

綜上所述，腦梗死患者PLGF水平較非腦血管病患者明顯升高，提示PLGF可能通過促進(jìn)血管生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)保護(hù)神經(jīng)、促進(jìn)側(cè)支形成等多種不同機(jī)制參與了腦梗死的病理生理過程；另一方面PLGF水平還與腦梗死面積密切相關(guān)，在一定程度上可作為判斷腦梗死患者的病情程度的血液學(xué)指標(biāo)。

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