FAM96A在結(jié)腸癌組織中的表達差異及其對結(jié)腸癌細胞增殖和凋亡的影響

孫 康，鐘藍海，張 楊，馬丹丹，蔡 遜，田 俊

結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移與眾多基因、分子異常表達密切相關(guān)[1]。研究[2]顯示，96序列相似的家庭成員A (family with sequence similarity 96, member A , FAM96A)在胃腸道間質(zhì)瘤中表達顯著降低，過表達FAM96A于間質(zhì)瘤細胞中，抑制細胞增殖，增加凋亡敏感性誘導(dǎo)細胞凋亡，減少致瘤性，且對FAM96A功能的研究有助于開發(fā)新型間質(zhì)瘤療法。目前國內(nèi)外關(guān)于FAM96A在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究報道甚少。該研究主要觀察FAM96A在結(jié)腸癌組織中的表達差異，并分析其表達差異與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理特征的關(guān)系，并探討其對結(jié)腸癌細胞系HCT116細胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1病例資料收集中國人民解放軍武漢總醫(yī)院普通外科2015年7月～2016年7月60例結(jié)腸癌組織標本及距腫瘤邊緣>5 cm處為準的癌旁組織標本，離體后液氮灌暫時存放并運送至-80 ℃ 超低溫冰箱中長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑FAM96A、β-actin一抗及二抗均購自英國Abcam公司； TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購自大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司；總蛋白抽提試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒及蛋白濃度檢測試劑盒均購自美國Invitrogen公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、MTT均購自日本Sigma公司。人肝癌細胞系HepG2細胞、人正常胎肝L02細胞均保存于本院中心實驗室。β-actin F：5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，R：5′-GCCAT CTCTTGCTCGAAGTC-3′；FAM96A F：5′-GCAAAGCA CGCTGGAACT-3′，R：5′-GGCCGAGACAAGCCTAAA-3′均由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)公司設(shè)計并合成。本研究所需pcDNA3.1-myc-FAM96A重組質(zhì)粒由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系田俊教授惠贈。

1.3Real-timePCR檢測FAM96A基因表達提取60例結(jié)腸癌組織及配對癌旁組織的總mRNA(參照TRIzol試劑盒操作說明書)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩eal-time PCR總反應(yīng)體系為20 μl：2×SYBR Green mix緩沖液10 μl+上下游引物各0.6 μl(濃度為：10 μmol/L)+cDNA 2 μl+DEPC水6.8 μl。反應(yīng)條件為變性、退火及延伸。本實驗中，肝癌組織和細胞所用FAM96A 和β-actin引物、Real-time PCR總反應(yīng)體系和設(shè)定的反應(yīng)條件均相同，由Real-time PCR儀自動生成數(shù)據(jù)。

1.4Westernblot法檢測FAM96A蛋白表達分別稱取0.08～0.10 g結(jié)腸癌組織和配對癌旁組織，提取蛋白并定量。各組取120 μg上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。PVDF膜轉(zhuǎn)移蛋白， 封閉一抗，標記二抗，化學(xué)發(fā)光法顯影檢測。

1.5MTT法檢測HCT116細胞活性取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，24 h后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時轉(zhuǎn)染。分為FAM96A組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-myc-FAM96A質(zhì)粒)和對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-vector空白質(zhì)粒)。酶標儀檢測各孔吸光度(absorbance, A)值，繪制細胞生長曲線，其中橫縱坐標分別為時間和A值。

1.6流式細胞儀檢測HCT116細胞凋亡將細胞收集后，按照說明書加5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻，用流式細胞儀檢測并分析細胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1FAM96A在結(jié)腸癌中的表達Real-time PCR檢測結(jié)果顯示：FAM96A mRNA在60例新鮮結(jié)腸癌組織和癌旁組織中均有表達，表達量分別為(0.376±0.169)、(1.009±0.248), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.328,P<0.05)，即FAM96A mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達顯著低于癌旁組織。Western blot檢測結(jié)果表明：結(jié)腸癌組織及癌旁組織中均可檢測到FAM96A蛋白表達，且FAM96A在結(jié)腸癌組織中的蛋白表達同樣低于癌旁組織。見圖1。

2.2FAM96A蛋白表達水平與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系FAM96A蛋白表達差異與本研究中60例結(jié)腸癌患者的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖1 FAM96A在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達

臨床病理特征n表達量t值P值性別 男320.383±0.1820.3320.741 女280.368±0.156年齡(歲) <60270.400±0.1850.9960.323 ≥60330.356±0.156腫瘤大小(cm) <5260.394±0.1800.7290.469 ≥5340.362±0.161分化程度 高中290.415±0.1881.770<0.05 低310.339±0.142浸潤深度 未及漿膜250.546±0.09312.869<0.05 侵及漿膜350.254±0.082淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性300.518±0.10712.214<0.05 陽性300.234±0.070遠處轉(zhuǎn)移 陰性500.420±0.1495.497<0.05 陽性100.157±0.035TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期280.530±0.10112.768<0.05 Ⅲ～Ⅳ期320.242±0.070

2.3MTT法檢測HCT116細胞活性實驗結(jié)果表明：FAM96A組A值顯著低于對照組(P<0.05)，即過表達FAM96A可顯著抑制HCT116細胞增殖，見圖2。

圖2 HCT116細胞生長曲線

2.4流式細胞儀檢測HCT116細胞凋亡率過表達FAM96A組的細胞凋亡率顯著高于對照組[(38.44±3.38)%vs(4.16±0.56)%，t=30.015，P<0.05]，即過表達FAM96A可誘導(dǎo)HCT116細胞凋亡。見圖3。

圖3 過表達FAM96A對HCT116細胞凋亡的影響

3 討論

FAM96A與FAM96B屬同源蛋白，均含有DUF59結(jié)構(gòu)域，具有50%的序列同一性，不同的是FAM96A具有預(yù)測的信號序列而FAM96B沒有，均為分子量18 ku的小分子蛋白，均通過相互作用蛋白發(fā)揮功能，具體機制不明確。研究[3]表明FAM96A與CIA2A組成蛋白復(fù)合物CIA2A-FAM96A維持細胞鐵穩(wěn)態(tài)。目前國內(nèi)外研究[4-6]顯示：FAM96B在結(jié)腸癌組織中低表達且抑制結(jié)腸癌細胞HCT-116增殖并促進凋亡，然而關(guān)于FAM96A在結(jié)腸癌中的功能研究報道甚少。因此，本研究旨在探索FAM96A在結(jié)腸癌組織中的表達差異及細胞生物學(xué)功能，以期為結(jié)腸癌診斷和治療提供新的靶點和思路。

分析基因與腫瘤關(guān)系的基礎(chǔ)是觀察腫瘤組織及配對癌旁正常組織的差異性表達，異常表達的基因可認為是潛在的新一類控制細胞增殖和凋亡的癌基因或抑癌基因，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。本研究中收集60例結(jié)腸癌組織及相應(yīng)配對癌旁組織標本，分別采用Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測FAM96A在基因和蛋白水平的表達差異。檢測結(jié)果表明：FAM96A在結(jié)腸癌組織中的基因和蛋白表達水平均顯著低于癌旁組織。由此可見, FAM96A在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中具有抑癌基因特性，抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。Schwamb et al[2]認為FAM96A作為新的抑癌基因，在胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的腫瘤抑制作用。本實驗結(jié)果與其研究結(jié)論基本一致。

目前結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅人類健康與生命財產(chǎn)安全[8]。導(dǎo)致結(jié)腸癌低生存率的關(guān)鍵因素在于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]，其中肝臟轉(zhuǎn)移是最常見的遠處轉(zhuǎn)移[10]。因此，如能阻斷結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移途徑，則能大大提高結(jié)腸癌患者的生存率。本研究通過對FAM96A蛋白表達與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的相關(guān)性進行分析，得出FAM96A在結(jié)腸癌組織中低表達，與結(jié)腸癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)。提示FAM96A可能是一個與結(jié)腸癌浸潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子指標，在結(jié)腸癌發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵的抑制作用。

為進一步明確FAM96A在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的功能，本研究采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染法將FAM96A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細胞系HCT116細胞中，觀察FAM96A基因過表達對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)功能的影響。Schwamb et al[2]報道FAM96A是胞質(zhì)鐵硫蛋白簇聚集系統(tǒng)成員之一，在調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)方面起到關(guān)鍵作用。通過線粒體凋亡途徑對間質(zhì)瘤發(fā)揮促凋亡作用。過表達FAM96A可增強間質(zhì)瘤細胞GIST882凋亡敏感性，并在體內(nèi)和體外抑制腫瘤生長，F(xiàn)AM96A低表達或表達沉默將導(dǎo)致間質(zhì)瘤的發(fā)生。同時，Ito et al[4]報道FAM96B與MMS19、Ciao 1、XPD等組成蛋白復(fù)合物MMXD，定位于紡錘體，在有絲分裂染色體正常分離中發(fā)揮關(guān)鍵作用，F(xiàn)AM96B基因沉默可導(dǎo)致結(jié)腸癌細胞系HCT116細胞不能正常有絲分裂，異型細胞核堆積，細胞凋亡，是癌癥潛在的診斷和治療靶點。本研究中MTT及流式細胞儀檢測結(jié)果提示：過表達FAM96A可抑制結(jié)腸癌細胞系HCT116細胞增殖，并顯著誘導(dǎo)其凋亡。證實FAM96A促進結(jié)腸癌細胞系HCT116凋亡，但具體作用機制尚待進一步闡明，與國外文獻報道基本一致。

[1] Provenzale D, Jasperson K, Ahnen D J, et al. Colorectal cancer screening, version 1. 2015[J]. J Natl Compr Canc Netw, 2015, 13(8):959-68.

[2] Schwamb B, Pick R, Fernandez S B, et al. FAM96A is a novel pro-apoptotic tumor suppressor in gastrointestinal stromal tumors[J]. Int J Cancer, 2015, 137 (6) : 1318-29.

[3] Stehling O, Mascarenhas J, Vashisht A A, et al. Human CIA2A-FAM96A and CIA2B-FAM96B integrate iron homeostasis and maturation of different subsets of cytosolic-nuclear iron-sulfur proteins[J]. Cell Metal, 2013, 18(2):187-98.

[4] Ito S, Tan L J, Andoh D, et al. MMXD, a TFIIH-independent XPD-MMS19 protein complex involved in chromosome segregation[J]. Mol Cell, 2010, 39(4):632-40.

[5] 蔡 遜，馬丹丹，田 俊，等. FAM96B基因在結(jié)腸癌組織中低表達且抑制癌細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2016，45(2)：132-5.

[6] 蔡 遜，馬丹丹，張智勇，等. 96序列相似的家庭成員B基因在結(jié)腸癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 中華實驗外科雜志，2016，33(3)：567-70.

[7] Si M L, Zhu S, Wu H, et al. MiR-21-mediated tumor growth[J]. Oncogene, 2007, 26(19): 2799-803.

[8] Kin B N, Yamamoto H, Ikeda K, et al. Methylation and expression of P16NK4 tumor suppressor gene in primary colorectal cancer tissues [J]. Int J Oncol, 2005, 26(5):1217-26.

[9] Parkin D M, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics,2002[J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2):74-108.

[10] Hanahan D, Weinberg R A. The hallmarks of cancer[J]. Cell, 2000, 100(1):57-70.