靶向MDM2-p53相互作用的抗癌治療研究進展

王 樾，吳文涌 綜述 吳正升 審校

隨著分子生物學的發展，人們發現惡性腫瘤的發生、發展與多種因素有關，其中癌基因和抑癌基因的異常表達是細胞癌變的重要原因之一。鼠雙微體基因2(murine doubleminute 2，MDM2)是迄今為止發現的最強的凋亡抑制因子之一，是一種與惡性腫瘤密切相關的癌基因[1]。它是一種泛素-蛋白連接酶，參與泛素對靶蛋白的標識，進而導致靶蛋白通過蛋白酶體而被降解，其編碼的蛋白質可以與p53蛋白結合，負性調節p53蛋白，進而導致抑癌基因p53的失活，使細胞發生轉化、增殖和惡變的能力增強[2]。在人類腫瘤中，MDM2蛋白的過度表達可以由基因擴增引起，在基于28種不同類型的腫瘤，約4 000個腫瘤樣本的分析中顯示，MDM2基因平均在約7%的腫瘤樣本中擴增，擴增幅度為2～10倍[3]。MDM2和p53通過負反饋環路相互調節[4]，因此靶向MDM2的藥物可以重新活化野生型p53，通過利用p53強大的腫瘤抑制功能，該類藥物可能實現治療人類癌癥的潛能。該文概述了靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制劑在抗癌治療中的研究進展。

1 MDM2基因和蛋白質結構及其與p53的相互作用

MDM2最初由Linda et al[5]從含有雙微體的自發轉化小鼠Balb/c3T3成纖維細胞系(3T3DM)中克隆出來的一個高度擴增的基因。該基因在進化過程中保守，不同物種細胞染色體上都有其同源序列。1992年，Oliner et al[6]在染色體12q13-14上鑒定出人MDM2基因。人MDM2基因的cDNA開放閱讀框為5'端到第1784位核苷酸，起始密碼ATG從312位核苷酸開始，第181～185位密碼子為核定位信號，第305～322位密碼子為酸性活化域。進一步研究[7]顯示MDM2蛋白具有4個功能區：I區包括N端約100個氨基酸殘基，是MDM2-p53相互結合的部位，也可以直接結合到基因啟動子上，激活基因轉錄；II區為高度酸性區域，能與核糖體15蛋白及5s rRNA結合；III區含有一個鋅指結構，具有轉錄因子的活性，促進細胞由G1期進入S期；IV區含有一個環指結構，可介導蛋白質之間的相互作用，也能結合DNA或RNA，參與細胞周期調控，促進細胞增殖。

p53可分為野生型p53和突變型p53兩種，是目前研究最為深入的抑癌基因[8]，在細胞周期調節和細胞凋亡中起著重要作用。野生型p53是抑癌基因，當外界因素使DNA受到損傷且難以修復時快速誘導細胞發生凋亡，防止具有潛在癌變可能性的細胞產生，從而有效地發揮抑癌作用。當野生型p53轉變為突變型p53時，突變型p53起到了原癌基因的作用，在腫瘤細胞中穩定存在，并在腫瘤細胞核內積累，最終導致腫瘤的發生[9]。MDM2為p53的下游效應基因之一，同時可以與p53的轉錄活性區，即N端結合，從而抑制p53對其下游基因的轉錄促進功能。這種作用機制在p53與MDM2間建立了一個負反饋調節環[10]。在DNA損傷時，機體需要p53的臨時活化來抑制異?；蚴軗p細胞的進一步增殖，并誘導受損及異常細胞的DNA修復或凋亡。此時，p53會發生明顯的磷酸化，使MDM2與p53的結合力降低，從而降低MDM2對p53的抑制作用。當p53失去了MDM2對其的抑制作用后，就可以有效地增加下游基因轉錄，誘導細胞周期停滯或凋亡[11]。MDM2主要通過三種機制調節p53的功能：① MDM2和p53在細胞核內結合后，通過其E3泛素連接酶活性直接泛素化p53，促進p53發生蛋白酶體降解；② MDM2與p53的相互作用阻斷了p53與其靶DNA的結合，使p53成為無效的轉錄因子；③ MDM2促進p53從細胞核中輸出，使p53無法與靶DNA結合，進一步降低其轉錄調節能力[7,12-13]。因此，當MDM2對p53的抑制過強時，DNA受損傷的細胞就可以繼續增殖從而導致腫瘤形成。MDM2蛋白通過抑制p53的轉錄活化功能和抗腫瘤活性，促進腫瘤的形成，并與腫瘤的進展和預后有關[14]。

2 靶向MDM2-p53相互作用的抗癌治療

MDM2依賴于其與p53相互作用的幾種機制來抑制p53功能，所以設計用于阻斷MDM2-p53相互作用的肽類或非肽類小分子可以導致p53蛋白的增加，利用p53強大的腫瘤抑制功能，這類化合物可能具有治療人類癌癥的潛能。生物化學研究[15]表明MDM2和p53是通過MDM2蛋白氨基末端的120個氨基酸殘基和p53蛋白氨基末端的30個氨基酸殘基相互作用的。對p53蛋白N端的11個氨基酸和MDM2蛋白N端109個氨基酸片段的復合物進行晶體X線衍射研究，顯示MDM2-p53結合界面的表面積為14.98 nm2，二者之間主要以疏水作用結合[16]。MDM2疏水裂隙界面上排列有14個芳香性和疏水性氨基酸，p53疏水面與MDM2螺旋結合，另一側與MDM2折疊接近，使Phe19、Trp23和Leu26嵌入到MDM2疏水裂隙中，結合界面另有兩處分子間以氫鍵相連。這些結構特征為設計能夠阻斷MDM2-p53相互作用的非肽類藥的小分子抑制劑提供了可行性。下面介紹幾類靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制劑，見表1。

2.1第一個靶向MDM2-p53相互作用的強效、特異的小分子抑制劑Nutlins盡管高校實驗室和制藥公司進行了大量的研究工作，但設計靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制劑比預期要困難得多。隨著美國羅氏公司的Vassilev et al[17]發現了Nutlins打破了這一局面。在最初的關于Nutlins的報道顯示[17]，Nutlin-3a以90×10-9mol/L的半數最大抑制濃度值(half-maximal inhibitory concentration，IC50)從MDM2-p53相互作用中置換出p53，并且表現出與p53結合MDM2相一致的作用機制。Nutlin-3a有效地激活癌細胞中的野生型p53，通過劑量依賴的方式保留了野生型p53的抑制癌細胞系生長的作用，并對p53突變或p53缺失的癌細胞系表現出>10倍的選擇性。Nutlin-3a具有口服的生物藥效性，每日兩次口服給藥(高劑量:100或200 mg/kg)的情況下，可有效抑制含有MDM2基因擴增的人骨肉瘤細胞系SJSA-1的小鼠異種移植瘤模型中腫瘤的生長，而小鼠并未顯示中毒跡象。Nutlin-3a的類似物Nutlin-2與MDM2復合物的共晶體結構顯示，該Nutlins模擬三個關鍵的p53結合殘基(Phe19、Trp23和Leu26)[17]。在應用Nutlins所獲得的臨床前數據顯示，靶向MDM2-p53相互作用的高效、選擇性、非肽類的小分子抑制劑可能具有保留野生型p53功能，治療人類癌癥的潛力[17]。Nutlins的發現同時也激勵著其他研究小組去探索具有更加高效和選擇性，具有更好的藥代動力學特點的新型MDM2抑制劑。

2.2第一個進入人體臨床試驗的MDM2抑制劑RG7112來自美國羅氏公司的科學家通過進一步優化Nutlin-3a的細胞效能、藥代動力學特性、化學穩定性及對MDM2的親和力，發現了第一個進入人體臨床試驗的MDM2抑制劑RG7112(RO5045337)[18]。RG7112與MDM2的親和力(IC50=18×10-9mol/L)比Nutlin-3a更好，其有效地抑制了含有野生型p53的癌細胞系的生長，并且比Nutlin-3a的效力高數倍，同時對具有突變型p53的癌細胞系顯示出良好的選擇性。RG7112在體內外試驗中有效地激活了野生型p53，并在小鼠中顯示出良好的口服藥代動力學特性[18]。在具有MDM2基因擴增和蛋白過表達的SJSA-1和MHM骨肉瘤細胞系的兩種小鼠異種移植瘤模型中，通過口服RG7122表現出劑量依賴性地抑制腫瘤生長，并且能夠達到腫瘤部分消退，且小鼠未顯示中毒跡象[18]。

表1 靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制劑的來源、結構和特點

2.3其他靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制劑采用基于結構的設計策略，Ding et al[24]開發出了一類稱為螺-羥吲哚類化合物的、新型的非肽小分子MDM2抑制劑。通過對其進行廣泛的優化，于是發現了MI-77301[19]和MI-888[20,25]，它們結合MDM2的抑制常數Ki值分別為0.88×10-9mol/L和0.44×10-9mol/L，并且在結合力測定中比Nutlin-3a的效能強50倍以上。在人類癌細胞系中,MI-77301和MI-888在30×10-9～100×10-9mol/L濃度時均能有效激活野生型p53；與其對MDM2的更高的親和力和更高的p53活化能力一致，這兩種化合物在抑制含有野生型p53的癌細胞系增殖方面比Nutlin-3a顯示出高10倍的效能[19，25]，并且對擁有p53突變或p53缺失的癌細胞系顯示出>100倍的選擇性。在SJSA-1細胞系的小鼠異種移植瘤模型中，兩種化合物分別通過每日口服給藥，均能夠實現完全和持久的腫瘤消退，而小鼠沒有顯示中毒跡象[19，25]。MI-77301與人MDM2蛋白復合物的共晶體結構顯示，與其最初的設計一致，MI-77301模擬了三個關鍵的p53結合殘基，而且還參與額外的疏水鍵和氫鍵與MDM2相互作用；其中MI-77301中的取代苯基與MDM2的His96殘基具有π-π堆積作用；其還誘導MDM2氨基末端區域的非結構性10-25位氨基酸殘基的重新折疊，使這些氨基酸殘基成為結合區域的一部分，并進一步增加MDM2與MI-77301親和力[19]。

美國安進公司的科學家們通過基于結構的設計和廣泛地優化發現了含有哌啶-2-酮支架結構的AMG-232[21，26]。AMG-232與MDM2結合的親和力指數Kd值為0.045×10-9mol/L，并且AMG-232可能是迄今為止報道的最有效的MDM2抑制劑[26]，它分別以9.1×10-9mol/L和10×10-9mol/L的IC50值在SJSA-1和HCT-116細胞系中抑制細胞增殖，并且顯示出對p53基因敲除的HCT-116細胞系超過1 000倍的選擇性。AMG-232還可以有效抑制SJSA-1骨肉瘤細胞系異種移植瘤動物模型中的腫瘤生長，并在每天口服60 mg/kg AMG-232的12只動物中有10只動物實現了完全的腫瘤消退[21，26]。雖然AMG-232與MDM2復合物的共晶體結構尚未明確，但有研究[21，26-27]AMG-232衍生物與MDM2復合物的幾種高分辨率共晶體結構，并對AMG-232衍生物與MDM2復合物進行結構上的分析。這些共晶體結構顯示，這類MDM2抑制劑也很好地模擬了與MDM2相互作用的三個關鍵的p53結合殘基。與MI-77301一樣，這類MDM2抑制劑同樣誘導了MDM2蛋白氨基末端的重組，并促進了小分子抑制劑與MDM2中Val14和Thr16殘基之間額外的疏水鍵接觸[27]。

基于MI-77301的早期類似物MI-219，來自美國羅氏公司的科學家們設計了一類新的MDM2抑制劑RG7388(RO5503781)[22]，并將其納入臨床研究。RG7388以6×10-9mol/L的IC50結合MDM2，有效的抑制含有野生型p53的癌細胞系生長，并且對擁有p53突變的癌細胞系顯示出>100倍的選擇性。RG7388在動物中具有良好的微粒體穩定性和藥代動力學特性，其在口服給藥的小鼠SJSA-1骨肉瘤細胞系異種移植瘤模型中實現腫瘤完全消退[22]。目前RG7388在實體腫瘤和血液系統腫瘤中的作用正在進行臨床研究。瑞士諾華公司最近公布了一類含有二氫異喹啉支架結構的新一代MDM2抑制劑NVP-CGM097，并將其納入臨床研究[23]。NVP-CGM097在靶向MDM2-p53相互作用方面具有物種差異性，在人體內比狗和大鼠體內分別強效16和37倍。NVP-CGM097以1.7×10-9mol/L的IC50結合MDM2，比Nutlin-3a約有效4倍，在體內外已被證明是一個強效且選擇性的MDM2抑制劑，目前正在進行Ⅰ期臨床試驗[23]。

3 MDM2抑制劑臨床試驗結果

3.1RG7112的臨床試驗結果RG7112是進入人體臨床試驗的第一個MDM2抑制劑。因為超過80%的脂肪肉瘤具有MDM2基因的擴增和MDM2蛋白的過表達，所以在化療初治的脂肪肉瘤患者中評估了RG7112的治療效果，并報道了I期試驗結果[28]。RG7112通過口服給藥可以獲得良好的人體藥代動力學特性，同時在腫瘤細胞中檢測到p53的激活、p21蛋白的增加和凋亡誘導現像。根據實體腫瘤療效評價標準，在脂肪肉瘤患者中觀察到了RG7112的抗腫瘤活性，20例患者中有14例病情穩定，1例患者出現病情好轉，其余5例患者(均為未分化肉瘤)出現了病情進展。所有接受RG7112治療的患者至少有1例不良反應事件，在8例患者中觀察到有12例嚴重不良事件，其中包括中性粒細胞減少癥(6例)和血小板減少癥(3例)。RG7112的臨床研究[28]數據表明，患者RG7112的血漿暴露與觀察到的血液學毒性相關，因此，晚期血液學毒性，特別是血小板減少癥，應在MDM2抑制劑的未來臨床試驗中加以充分考慮。

3.2其他MDM2抑制劑的臨床試驗結果除RG7112外，至少6種其他MDM2抑制劑已經進入臨床研發，但是目前僅僅公布了其中2種MDM2抑制劑的研究結果。

RG7388的I期臨床研究[29]數據已經公布。RG7388的最大耐受劑量是500 mg，每日1次×5 d；500 mg，每日2次×3 d或者1 600 mg，每周2次。通過每日1次給藥，連續5 d，或每日2次給藥，連續3 d檢測p53的活化情況，結果表明前者給藥方案具有更強的p53活化功效。而每周2次給藥劑量情況下未觀察到確切的p53激活。血小板減少癥、中性粒細胞減少癥、發熱性中性粒細胞減少癥和腹瀉是RG7388的劑量限制性毒性反應。FLT-PET顯示RG7388可以明顯減少腫瘤細胞的增長。推薦RG7388的II期臨床研究劑量為500 mg，每日1次，連續5 d的給藥方案。

法國賽諾菲公司首次評估了單藥MI-77301(SAR405838)用于晚期癌癥患者的安全性、耐受性、藥代動力學特性和生物活性。MI-77301單藥Ⅰ期臨床試驗的初步研究結果在2015年第51屆美國臨床腫瘤學會年會上發表[30]。MI-77301的最大耐受日劑量為300 mg，且在可接受的安全劑量范圍內MI-77301激活了p53。對來自18個未分化脂肪肉瘤患者的血漿和腫瘤樣品的分析顯示，在MI-77301治療期間，患者的血漿游離DNA中出現了TP53(編碼p53蛋白)基因的突變。這是對MDM2抑制劑誘導p53突變進行的首次研究，顯示所有的p53突變點位于p53的DNA結合結構域，此外，在治療期間突變變異的等位基因頻率也增加，患者中出現了多樣性p53突變，且所有接受5個或更多療程治療的患者均顯示了血漿游離DNA中p53突變的證據。

4 結語

通過高校實驗室和制藥公司的大量研究工作，已成功設計和合成幾類可以結合MDM2并阻斷MDM2-p53相互作用的高效、特異性、非肽類小分子抑制劑。目前至少有7種這樣的化合物進入癌癥治療的臨床研究，且這些優化的MDM2抑制劑在動物口服給藥方面表現出優異的藥代動力學特點，其中幾種MDM2抑制劑在人類腫瘤動物模型中實現了完全的腫瘤消退。來自RG7112、RG7388和MI-77301的初步臨床試驗數據顯示，這些MDM2抑制劑在安全性的給藥劑量下有效激活了p53，并且觀察到確切的抗腫瘤活性的證據。這進一步支持靶向MDM2-p53相互作用會導致野生型p53激活，并作為一種新的癌癥治療策略。

基于三種化合物(RG7112、RG7388和MI-77301)的Ⅰ期臨床研究數據表明，MDM2抑制劑可以激活患者的野生型p53，并具有可接受的安全性。然而，使用MDM2抑制劑過程中以下問題還應加以考慮：首先，由于骨髓中p53的活化引起的劑量限制性毒性，這必須通過劑量優化來緩解。其次，起初含有野生型p53的腫瘤在用MDM2抑制劑治療后出現了p53突變。由于基于臨床前研究數據的MDM2抑制劑僅對含有野生型p53的腫瘤有效，預期對具有突變型p53的腫瘤細胞具有抵抗性。為了克服這種藥物誘導的抵抗性問題，在臨床前研究和臨床試驗中，都應探討MDM2抑制劑與有效殺滅含有突變型p53的腫瘤細胞的藥物聯合使用。

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