miR-133b通過靶向調控EGFR影響食管鱗癌的侵襲、轉移

曾 薇， 朱金峰，孔德華，單 莉

食管鱗癌的侵襲、轉移是多因素的綜合作用，是多基因變化積累、疊加的結果。隨著miRNA的生成及功能異常在多種腫瘤發生、發展中的作用被逐漸認識[1]，miRNA在食管鱗癌侵襲、轉移中的機制研究越來越受到人們的關注[2]。miRNA長約20～24 nt，主要通過轉錄后或翻譯水平調控基因表達[3]。目前研究[4]顯示，在食管鱗癌組織中低表達的miR-133b可能作為抑癌基因，參與食管鱗癌的演進，并預測 miR-133b 可能作為食管鱗癌治療的潛在靶點。該研究將對miR-133b參與食管鱗癌侵襲、轉移的具體作用及機制做進一步的研究討論。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 人食管鱗癌細胞系ECA109、KYSE150購自ATCC細胞庫。所有細胞為90% RPMI 1640培養基加10%胎牛血清，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養。DMEM 培養基用于Transwell 實驗。

1.1.2組織標本 收集2008年1月～2010年12月新疆醫科大學附屬腫瘤醫院胸外科手術切除的食管鱗癌組織標本，包括腫瘤及與其配對的正常食管黏膜組織。所有患者術前未接受化療、放療或其他任何相關的抗腫瘤治療。根據UICC TNM (第七版)分期。所有臨床標本經過新疆醫科大學附屬腫瘤醫院病理科專家診斷證實。臨床標本的切取均通過新疆醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準，并征得患者的同意簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1運用生物信息學方法預測miR-133b的靶基因 運用MiRbase、Targetscans及PicTar數據庫預測 miR-133b的候選靶基因。

1.2.2細胞轉染 轉染前1 d，細胞生長密度達70%～80%。轉染當天，使用250 μl無血清Opti-MEM I培養基稀釋miR-133b mimic/negative control 4.0 μg，輕輕混勻，室溫下靜置5 min。同時將LipofectamineTM2000 10 μl稀釋于250 μl無血清Opti-MEM I培養基中，輕輕混勻，室溫下靜置5 min。分別混合LipofectamineTM2000和miR-133b mimic/miR-133b negative control的稀釋液，室溫下靜置20 min。6孔板的每個孔中加入混合液500 μl。4 h后更換細胞培養液，于37 ℃、CO2培養箱中繼續培養48 h，用于后續檢測。

1.2.3熒光定量PCR技術(qRT-PCR) 查找基因序列，設計引物，見表1。引物由上海生工合成。使用ABI7500型定量PCR儀。TRIzol法提取組織RNA。逆轉錄反應體系10 μl為：5×PrimerScript RT Master Mix 2 μl、總RNA 500 ng、加無RNase酶的水至10 μl。反應條件為：37 ℃、15 min；85 ℃、5 s；4 ℃、5 min。qRT-PCR反應體系10 μl為：SYBR Premix Ex TaqII(2×)5 μl，上/下游引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase Free dH2O 2 μl。反應條件為：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s。每個基因的相對表達量以2-ΔΔCt法計算。

表1 qRT-PCR 實驗引物序列

1.2.4Western blot 收集細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，SDS-PAGE膠電泳，將蛋白電轉移到PVDF膜上，5%BSA封閉，一抗(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，ECL化學發光顯像。

1.2.5熒光素酶報告基因實驗 轉染前將細胞按70%的密度接種至96孔板。按比例配制報告基因質粒和轉染試劑即Firefly:Renilla:轉染試劑=0.1 μg:0.01 μg:0.25 μl，并常溫下孵育5 min。配制miR-133b mimic/negative control和轉染試劑的稀釋液：加入轉染試劑0.25 μl使miR-133b mimic/negative control的終濃度為100 nmol/L，常溫孵育5 min。將稀釋好的報告基因質粒、miR-133b mimic/negative control混勻，常溫孵育20 min，然后分別添加到每孔細胞樣品中。轉染6 h后，更換細胞培養基。48 h后棄去培養基，用100 μl 1×PBS洗1遍。每孔加50 μl稀釋好的 1×PLB，置于搖床上，常溫下15 min進行裂解。在白色不透光的96孔酶標板中每孔加入裂解液的上清液10 μl， 再加入100 μl預先混好的LAR Ⅱ，2 s后測數據，得到螢火蟲熒光素酶反應強度。每孔再添加100 μl預先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2 s后測數據，得到內參海腎熒光素酶反應強度。

1.2.6細胞增殖實驗 接種2×105個細胞至96孔板，48 h后加入新鮮配置的MTT溶液，37 ℃、5% CO2培養箱繼續孵育4 h后終止培養，每孔加入150 μl二甲基亞砜，酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的光密度(optical density,OD)值。

1.2.7細胞劃痕實驗 接種2×106個細胞至6孔板，待細胞完全融合后垂直劃出等寬的細胞劃痕，繼續培養48 h，并于相應時間段在顯微鏡下觀察劃痕寬度，同時拍照記錄。

1.2.8Transwell 實驗 ECA109、KYSE150細胞轉染24 h后(具體轉染步驟詳見方法1.2.2)，胰酶消化并制備單細胞懸液，以5×104個細胞密度接種于Transwell小室，24孔板下層加入750 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基，70 h后計算細胞過膜率。

2 結果

2.1生物信息學分析預測miR-133b的靶基因本研究主要探索miR-133b調控其靶基因參與食管鱗癌侵襲、轉移的機制。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)所參與的信號通路，與腫瘤的侵襲、轉移密切相關。故本研究鎖定在3個miRNA數據庫中miR-133b靶基因預測結果的交集-EGFR，作為miR-133b的預測靶基因進行下一步的研究。見表2。

表2 miR-133b與靶基因EGFR的結合序列

2.2雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-133b的靶基因為證實miR-133b對其靶基因EGFR的調控作用，課題組構建了EGFR野生型及突變型質粒進行雙熒光素酶報告基因實驗。具體實驗分組如下：MT組即插入了EGFR突變型質粒3′UTR片段的螢光素酶報告基因載體，WT組即插入了EGFR野生型質粒 3′UTR片段的螢光素酶報告基因載體，NC組即螢光素酶報告基因載體。在食管鱗癌細胞ECA109、KYSE150中，通過轉染miR-133b mimics，檢測各組的熒光素酶活性，判斷miR-133b對EGFR的調控作用。結果顯示：轉染miR-133b mimics對MT組和NC組的熒光素酶活性影響不顯著，但能使WT組的螢光素酶活性明顯下降(ECA109:t=20.24vsNC組，P<0.01，KYSE150:t=14.07vsNC組，P<0.01)，提示miR-133b可直接靶向調控EGFR，見圖1。

圖1 雙熒光素酶報告基因實驗檢測轉染miR-133bmimics對各實驗組熒光素酶活性的影響

2.3miR-133b對食管鱗癌細胞中EGFR表達的影響采用qRT-PCR、Western blot實驗檢測miR-133b對EGFR表達的影響。實驗分組如下：miR-133b mimics組即在食管鱗癌細胞中轉染miR-133b mimics；negative control組即在食管鱗癌細胞中轉染negative control。qRT-PCR結果顯示，在食管鱗癌細胞ECA109、KYSE150中，與negative control組相比，miR-133b mimics組中miR-133b在轉錄水平的表達顯著上調，提示轉染有效(ECA109:t=9.28vsnegative control組，P<0.01； KYSE150:t=35.53vsnegative control組，P<0.01)。但與negative control組相比，miR-133b mimic組中EGFR在轉錄水平的表達無顯著變化，見圖2A～D。Western blot結果顯示，在食管鱗癌細胞ECA109、KYSE150中，與negative control組相比，miR-133b mimics組中EGFR在蛋白水平的表達發生顯著下調，見圖2E。

2.4miR-133b抑制食管鱗癌細胞增殖采用MTT實驗檢測miR-133b對食管鱗癌細胞增殖的影響。實驗分組同2.3中描述。結果顯示，在食管鱗癌細胞ECA109、KYSE150中，與negative control組相比，72 h時miR-133b mimics組細胞的增殖能力顯著下降(ECA109:t=4.18vsnegative control組，P<0.05，KYSE150:t=11.18vsnegative control組，P<0.01)，提示miR-133b 能夠抑制食管鱗癌細胞的增殖，對腫瘤的生長起抑制作用，見圖3。

2.5miR-133b抑制食管鱗癌細胞遷移采用細胞劃痕實驗檢測miR-133b對食管鱗癌細胞遷移能力的影響。實驗分組同2.3中描述。結果顯示，在食管鱗癌細胞ECA109中，negative control組、miR-133b mimics組細胞劃痕閉合率分別為(42.00%±4.36%)、(14.00%±4.58%)，差異有統計學意義(t=7.67vsnegative control組，P<0.01)；食管鱗癌細胞KYSE150中，negative control組、miR-133b mimics組細胞劃痕閉合率分別為(52.33%±5.86%)、(22.00%±4.36%)，差異有統計學意義(t=7.19vsnegative control組，P<0.01)；上述實驗提示，上調miR-133b表達可以抑制兩種食管鱗癌細胞的遷移，見圖4。

2.6miR-133b抑制食管鱗癌細胞侵襲采用Transwell實驗檢測miR-133b對食管鱗癌細胞侵襲能力的影響。實驗分組同2.3中描述。結果顯示，在食管鱗癌細胞ECA109中，negative control組、miR-133b mimics組細胞過膜數分別為(78.67±7.02)、(19.67±3.06)，差異有統計學意義(t=14.02vsnegative control組，P<0.01)；在食管鱗癌細胞KYSE150中，negative control組、miR-133b mimics組細胞過膜數分別為(87.33±5.77)、(24.67±7.37)，差異有統計學意義(t=11.59vsnegative control組，P<0.01)；上述實驗提示，上調miR-133b表達對兩種食管鱗癌細胞的侵襲能力具有抑制作用，見圖5。

2.7miR-133b及EGFR在食管鱗癌組織中的表達采用qRT-PCR 實驗檢測miR-133b與EGFR在33例食管鱗癌組織中的表達，并進行相關性分析。結果顯示，miR-133b在食管鱗癌組織中的表達下調，EGFR在食管鱗癌組織中的表達上調，二者表達呈負相關性(P<0.01)，見圖6。將miR-133b的表達與食管鱗癌患者的臨床病理特征進行相關性分析顯示：miR-133b的表達與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移相關，即miR-133b在Ⅰ/Ⅱ期食管鱗癌中的陽性表達率顯著高于Ⅲ期 (P<0.05)、miR-133b在淋巴結陰性食管鱗癌中的陽性表達率顯著高于淋巴結陽性食管鱗癌(P<0.05)，見表3。

圖2 miR-133b對EGFR在轉錄和蛋白水平表達的影響

A：ECA109細胞轉染miR-133b mimics 檢測miR-133b轉錄水平的表達；B：KYSE150細胞轉染miR-133b mimics 檢測miR-133b轉錄水平的表達；C：ECA109細胞轉染miR-133b mimics 檢測EGFR轉錄水平的表達；D：KYSE150細胞轉染miR-133b mimics 檢測EGFR轉錄水平的表達；E：ECA109、KYSE150細胞轉染miR-133b mimics 檢測EGFR蛋白水平的表達；與negative control組比較：*P<0.05

圖3 miR-133b對兩種食管鱗癌細胞增殖的影響

圖4 miR-133b對兩種食管鱗癌細胞遷移能力的影響 ×200

圖5 miR-133b對兩種食管鱗癌細胞侵襲能力的影響 ×200

A：ECA109 negative control組；B：ECA109 miR-133b mimics組；C：KYSE150 negative control組；D：KYSE150 miR-133b mimics組；與negative control組比較：*P<0.05

表3 miR-133b表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系

3 討論

圖6 食管鱗癌組織中miR-133b與EGFR的表達及相關性分析

食管癌位居全球惡性腫瘤發病率的前列[5]。中國是食管癌的高發區。Chen et al[6]2016年的統計分析指出，中國食管癌的發病率為477 900例，接近全球食管癌發病的50%。其中食管鱗癌占食管癌發病的90%以上，其惡性程度高，預后差，多數食管鱗癌在確診時即分期較晚，喪失手術機會，并且一些食管鱗癌在早期既有較強的侵襲和轉移趨勢[7]。 在過去的幾十年中，隨著外科技術的提高以及新輔助化放療技術的運用，食管鱗癌患者的預后有了一定程度的改善，但患者的5年生存率仍然較低[8]。

如果能尋找到與食管鱗癌侵襲、轉移相關的分子生物學標志物，在食管鱗癌患者中發現侵襲、轉移的高危人群并進行有針對性的治療，將有望改善食管鱗癌患者的預后[9]。

目前越來越多的證據顯示，miRNA的異常表達在腫瘤的侵襲、轉移中發揮著重要的調控作用[10]。Fu et al[4]研究發現miR-133b在食管鱗癌中呈低表達，且miR-133b的差異表達與食管鱗癌的侵襲、轉移相關。Kano et al[11]發現在食管鱗癌細胞中上調miR-133b，可以抑制細胞增殖、阻止腫瘤細胞侵襲，提示miR-133b可能作為抑癌基因參與食管鱗癌的發生、發展。Qin et al[12]研究發現，miR-133b在食管鱗癌組織和細胞中均呈低表達，上調食管鱗癌細胞中miR-133b的表達，可對食管鱗癌的上皮間充質轉化起負調控作用，提示miR-133b在食管鱗癌的轉移中發揮著重要的作用。

EGFR屬于ErbB受體家族。研究[13]顯示，在多種實體瘤中，EGFR的過表達與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移、凋亡以及血管生成有關，而EGFR基因的突變則有助于上皮細胞發生惡性轉化。Jia et al[14]研究發現，在食管鱗癌組織中高表達的EGFR與腫瘤的淋巴結轉移、浸潤深度及TNM分期呈正相關。COX回歸分析顯示，EGFR可作為食管鱗癌患者的獨立預后因素。Wang et al[15]采用免疫組化法對癌前病變、早期食管鱗癌、進展期食管鱗癌組織中EGFR的表達進行檢測。結果顯示，EGFR的陽性表達率隨腫瘤的進展而增高。提示EGFR可能參與了食管鱗癌的發生、發展過程。Lin et al[16]研究發現，高表達的EGFR與腫瘤較差的分化程度相關，而EGFR的擴增則與腫瘤的分期、淋巴結的轉移相關，并提示EGFR的拷貝數增加可作為食管鱗癌預后判定的指標。

關于miR-133b和EGFR在腫瘤中的表達調控關系，目前已有一些研究報道。Liu et al[17]研究發現，miR-133b可通過調控EGFR表達，影響其下游通路的活化，從而抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲，促進細胞凋亡，提高EGFR-TKI藥物治療的敏感性。Tao et al[18]研究發現，在激素治療不敏感的PC3 和DU145前列腺癌細胞中，miR-133b可通過調控EGFR表達，影響細胞的增殖、侵襲、遷移。但目前對于食管鱗癌中miR-133b與EGFR之間的靶向調控關系，尚無研究報道。而本研究則對這一調控機制進行了初步的探索和驗證。在本研究中，課題組通過生物信息學預測EGFR為miR-133b的下游靶基因，并采用雙熒光素酶報告系統證實miR-133b可直接靶向作用于EGFR。在食管鱗癌細胞中證實通過轉染miR-133b mimic，上調miR-133b的表達，可以下調EGFR在蛋白水平的表達，并抑制食管鱗癌細胞的增殖、侵襲、遷移。在食管鱗癌組織中采用qRT-PCR實驗證實miR-133b呈低表達，EGFR呈高表達，且二者表達呈負相關性。將miR-133b的表達與食管鱗癌的臨床病理特征進行相關性分析顯示，miR-133b的表達與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移密切相關?；谏鲜鲅芯拷Y果，課題組推測在正常食管黏膜組織中miR-133b可能通過與其靶基因EGFR的3′-UTR端結合，通過維持EGFR在蛋白水平的正常表達，從而使正常食管黏膜組織細胞的增殖與凋亡處于動態平衡。而在食管鱗癌組織中，由于某種或多種原因導致的miR-133b的生成及功能異常，致使miR-133b的表達下調、miR-133b對EGFR表達的調控作用減弱，使EGFR在蛋白水平的表達上調，導致細胞增殖過度，細胞的侵襲及遷移能力增強，從而促進了腫瘤的進展。

但是，目前對于miR-133b的上游調控機制，miR-133b靶向調控EGFR參與食管鱗癌的侵襲、轉移過程的具體信號通路、以及下調食管鱗癌中EGFR的表達對miR-133b表達及食管鱗癌侵襲、轉移的影響，目前尚不完全清楚，在今后的實驗中課題組將針對上述問題進行進一步的探討。

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