腹腔注射環磷酰胺大鼠灌服補腎調沖方水煎劑后卵巢儲備功能觀察

張颯，高慧，徐文君，崔亞萌，李欣捧

(1華北理工大學，河北唐山063000 ；2河北省中西醫結合肝腎病證重點實驗室；3承德醫學院附屬醫院)

環磷酰胺是臨床應用較多的化療藥物，但有生殖毒性。卵巢儲備功能可以反映女性的生育潛能，主要是指卵巢內皮質區卵泡生長、發育、形成可受精卵泡的能力。如果卵巢受損或其他因素導致卵巢的功能減退則存儲卵母細胞的數量及質量會嚴重下降[1]。卵巢儲備功能低下是指卵巢內卵泡中所含卵母細胞儲存的數量和質量均呈下降，診斷標準一般為血清卵泡刺激素(FSH)10～40IU/L，黃體生成素(LH)10～30IU/L或FSH/LH>3，或雌二醇(E2)<43.9 pmol/L，或人抑制素B(INHB)<45 pg/mL，或抗苗勒管激素(AMH)<1.1 ng/mL。卵巢儲備功能低下如果長期得不到有效控制可進一步發展導致卵巢早衰[2]。目前卵巢儲備功能低下的發病機制尚不十分明確。從中醫角度分析，卵巢儲備功能低下的發病基礎以腎虛為本，本病的治療也應從腎和沖任角度出發，滋補肝腎，平衡陰陽，疏達肝氣，調理沖任氣血[3]。補腎調沖方全方配伍可平補腎氣、滋陰扶陽、調理沖任、理氣養血，整體上具有補而不滯、滋而不膩、活血而不動血的特點。卵巢組織衰老基因p53是一種經典的抑癌基因，位于細胞核內，蛋白主要分布于細胞質內，在細胞的生長周期、凋亡、衰老過程中均起著重要的作用。p53在 DNA 受損時被激活，致使細胞阻滯在 G1期，如果受損的 DNA 不能修復，則 p53 可促進受損細胞的凋亡，p53表達過高時預示著細胞停止生長或凋亡增加。有研究[4，5]表明減少p53游靶基因表達可以有效抑制細胞凋亡，降低細胞凋亡率。促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)是介導促性腺激素釋放激素(GnRH)功能不可或缺的物質。作為I型受體，GnRHR主要在次級卵泡、竇卵泡、排卵前顆粒細胞中表達，通過結合促性腺細胞中特異性極高的親和力受體，進而調節和控制卵巢的內分泌功能。GnRHR在排卵過程中極為重要，參與卵泡成熟和激素的生成，因此，GnRHR的升高預示著卵泡的生長與成熟[6]。本研究觀察了補腎調沖方預防大鼠卵巢儲備功能低下的效果，并探討補腎調沖方對大鼠卵巢組織p53、GnRHR表達的影響，探討補腎調沖方預防大鼠卵巢儲備功能低下的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 ①實驗動物：清潔級雌性SD大鼠60只，體質量230～270 g，由河北醫科大學動物實驗室提供，許可證號SCXK(冀)2013-1-0-3，合格證號是1702167；飼料為河北省實驗動物中心提供，合格證編號1702168。飲水為雙蒸水，實驗室清潔級，自然光照飼養動物。②主要試劑：環磷酰胺(注射用藥)：規格為0.2 g×1瓶×10瓶/盒，江蘇盛迪醫藥有限公司生產，生產批號20150617，批準文號國藥準字H32020857。補腎調沖方為高慧博導和韓冰教授經驗方。藥物組成：菟絲子15 g，黃精15 g，熟地15 g，肉蓯蓉10 g，巴戟天10 g，當歸10 g，川芎6 g，紫石英15 g，五味子6 g。所有中藥飲片由石家莊市中醫院中藥房藥劑科提供。藥材混勻，每 100 克藥材加800 mL 水按常規方法進行煎煮，濾汁濃縮至生藥2.5 g生藥/mL，4℃冰箱儲存。③主要儀器：FSH、E2、LH酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自天津九鼎醫學生物工程有限公司，AMH 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自北京華英生物技術研究所，p53、GnRHR、GAPDH引物購自北京博奧森生物技術有限公司。酶聯免疫檢測儀MK3 購自芬蘭雷勃；實時熒光定量PCR儀HEMIX-180購自日本Sysmex公司。

1.2 大鼠分組、卵巢儲備功能低下模型制備及補腎調沖方水煎劑應用方法 將50只SD清潔級雌性大鼠適應性喂養3～5 d，行陰道脫落細胞學涂片，光鏡下連續觀察1周，待大鼠處于動情周期時進入實驗。隨機將50只雌性大鼠分為空白組、模型組和補腎調沖方高、中、低劑量組，各10只。空白組自由飲水、正常喂養；其余各組大鼠每日上午腹腔注射20 mg/mL的環磷酰胺1次，劑量75 mg/kg以制備大鼠卵巢儲備功能低下模型。補腎調沖方高、中、低劑量組分別給予補腎調沖方水煎劑24、12、6 g/kg灌胃，，連續給藥36 d。模型組不給藥。

1.3 各組大鼠血清FSH、LH、E2、AMH檢測 將各組大鼠麻醉，取腹主動脈血，3 000轉/min離心10 min，取上層血清。采用ELISA法檢測血清FSH、LH、E2、AMH水平，按照試劑盒說明書操作。

1.4 各組大鼠卵巢組織p53、GnRHR mRNA檢測 將各組大鼠處死，剖腹摘取卵巢組織。取卵巢組織100 mg左右放入勻漿器內，加入適量的RNAiso Plus 用勻漿器勻漿，室溫靜置5 min，4 ℃下12 000轉/min離心5 min后加入氯仿，震蕩混勻后室溫靜置5 min，4℃下12 000轉/min離心15 min，加入異丙醇，混勻后室溫靜置10 min,4℃下12 000轉/min離心10 min，加入乙醇1 ml，4 ℃下12 000轉/min離心5 min。用TE Buffer稀釋后于紫外分光光度計260、280、320處讀取OD值，OD260/OD280值1.7～2.1方可使用。取總RNA 2 μg，加入RT反應體系管中，并用DEPC處理水補足到50 μL反應液體積，震蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于PCR儀42℃30 min(cDNA合成)，99 ℃ 5min( 逆轉錄酶失活)，5 ℃ 5 min。-20 ℃保存備用。采用實時熒光定量PCR法檢測p53、GnRHR mRNA，采用兩步法反應程序,預變性95 ℃10 min，然后進行40個循環反應：95 ℃10 S、60 ℃32 s。p53上游引物序列5′-CCCCTGAAGACTGGATAACTGT-3′，下游引物序列5′-AACTCTGCAACATCCTGGGG-3′；GnRHR mRNA上游引物序列5′-GCCTCAGCCTTGTCTCATGT-3′，下游引物序列5′-TATGTTGGGCTTTCCCGGTC-3′；內參照GAPDH上游引物序列5′-CCTCCTGAACTTGAGGCAGTTT-3′，下游引物序列5′-TGTATTGTAACCAGTCATCAGCA-3′。采用2-ΔΔCt表示p53、GnRHR mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠血清FSH、LH、E2、AMH水平比較 各組大鼠血清FSH、LH、E2、AMH水平見表1。與空白組相比，模型組大鼠血清 FSH、LH水平較高(P均<0.05)，E2、AMH水平較低(P均<0.05)。與模型組相比，補腎調沖方高、中、低劑量組大鼠血清LH、FSH水平降低(P均<0.05)，血清AMH、E2水平升高(P均<0.05)。補腎調沖方高、中劑量組大鼠血清FSH、LH、E2、AMH水平與空白組相比，P均>0.05；補腎調沖方低劑量組大鼠血清FSH、E2、AMH水平與空白組相比，P均<0.05；補腎調沖方低劑量組大鼠血清LH水平與空白組相比，P>0.05。

表1 各組大鼠血清E2、FSH、LH、AMH水平比較

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，△P<0.05。

2.2 各組大鼠卵巢組織p53、GnRHR mRNA表達比較 各組大鼠卵巢組織p53、GnRHR mRNA相對表達量見表2。與空白組相比，模型組大鼠卵巢組織p53 mRNA相對表達量升高(P<0.05)，GnRHR mRNA相對表達量降低(P<0.05)。與模型組相比，補腎調沖方高、中、低劑量組大鼠卵巢組織p53 mRNA相對表達量降低(P均<0.05)，GnRHR mRNA相對表達量升高(P均<0.05)。補腎調沖方高、中劑量組大鼠卵巢組織p53、GnRHR mRNA相對表達量與空白組相比，P均<0.05；補腎調沖方低劑量組大鼠卵巢組織p53、GnRHR mRNA相對表達量與空白組相比，P均>0.05。

3 討論

抗腫瘤藥物在對抗治療腫瘤的同時，對卵巢也具有較大的毒副作用，其中對卵巢功能影響最大的是烷化劑類藥物[11]，環磷酰胺是常用的烷化劑類藥物之一，具有高度卵巢毒性。它可作用于細胞DNA而引起DNA單鏈或雙鏈的斷裂，使DNA、RNA和蛋白質的合成被抑制，導致腺組織永久性損傷[12]，卵巢是雌性生殖毒性作用的主要靶器官[13]，化療藥物引發的卵巢功能衰退占卵巢衰退患患者的25%[14]。前期預實驗結果提示環磷酰胺可以導致大鼠動情周期紊亂,并逐漸出現血清FSH高而E2低的卵巢儲備功能低下狀態，與人類卵巢功能減退的表現大致一致。

表2 各組大鼠卵巢組織p53、GnRHR mRNA相對表達量比較

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，△P<0.05。

卵巢儲備功能低下是婦科常見的內分泌疾病，西醫治療主要以激素替代療法為主，可恢復患者月經和患者性激素水平，但長時間用藥可大大增加患者罹患乳腺疾病及其他婦科疾病的機率[7]。中醫雖無卵巢儲備功能低下病名，但根據癥狀可以將其歸為“月經過少”、“月經后期”等范疇。補腎調沖方主要由菟絲子、巴戟天、黃精、熟地黃、肉蓯蓉、當歸、川芎、紫石英、五味子9味藥材組成。諸藥合用，使腎之陰陽得以滋補，陰足則卵生，陽動則卵排，腎氣盛，任沖脈通，月事以時下[8，9]。本研究結果顯示，補腎調沖方高、中、低劑量組大鼠血清E2、AMH水平高于模型組，FSH、LH水平低于模型組，表明補腎調沖方具有激素樣作用，能有效改善卵巢儲備功能低下患者血清FSH高而E2低的狀態，維持卵巢正常生理功能[10]。但補腎調沖方高、中劑量組大鼠血清FSH、LH、E2、AMH水平與空白組相比，P均>0.05；補腎調沖方低劑量組大鼠血清FSH、E2、AMH水平與空白組相比，P均<0.05；補腎調沖方低劑量組大鼠血清LH水平與空白組相比，P>0.05。說明低劑量(6 g/kg)的補腎調沖方水煎劑灌胃因為劑量過小，預防效果不足；但中(12 g/kg)、高劑量(24 g/kg)的補腎調沖方水煎劑灌胃可以達到完全預防的目的，大鼠血清FSH、LH、E2、AMH水平與空白組相比已無統計學差異。

p53位于細胞核內，在 DNA 損傷時被激活，具有幫助細胞基因修復缺陷的功能，表達過高提示著細胞凋亡水平升高。GnRHR為I型受體，可能參與卵泡成熟和激素的生成，在排卵過程中極為重要，其表達升高預示著卵泡的生長與成熟。本研究結果顯示，模型組大鼠卵巢組織p53 mRNA表達增強而GnRHR mRNA表達降低，表明環磷酰胺可破壞正常的卵泡結構，導致卵巢激素分泌異常和儲備功能低下。補腎調沖方高、中劑量組大鼠卵巢組織p53 、GnRHR mRNA表達與空白組相比無統計學差異，表明補腎調沖方可能是通過調控p53 、GnRHR表達發揮預防卵巢功能低下的作用。同樣，補腎調沖方低劑量組預防效果不明顯，可能是因為劑量較低。

綜上所述，中、高劑量補腎調沖方水煎劑灌胃可以有效預防環磷酰胺導致的大鼠卵巢儲備功能低下，其機制可能與補腎調沖方對大鼠卵巢組織p53 、GnRHR mRNA表達的影響有關。臨床上使用環磷酰胺行抗腫瘤治療時可使用補腎調沖方預防其對卵巢的損害。

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