紫草素對宮頸癌細胞株Caski增殖、凋亡及HPV E6-E7 mRNA表達的影響

舒海燕，柯麗娜，陳富超，李斌

(湖北醫藥學院附屬東風醫院，湖北十堰 442008)

宮頸癌主要與人乳頭瘤病毒(HPV)的致病性密切相關[1]。HPV是一種結構簡單的DNA病毒，其中的E6和E7基因已被證實是癌基因[2]。E6、E7基因產生的蛋白分別可與抑癌性的p53和pRB蛋白結合,導致p53和pRB蛋白失活，破壞細胞的正常周期，最終導致癌變[3]。E6、E7基因是宮頸癌抗腫瘤治療的重要靶點。紫草素是從藥用紫草的根部提取的萘醌類化合物，具有多種生物學活性[4]，其抗腫瘤作用已得到業界的廣泛認可[5～7]。在宮頸癌方面，有相關文獻也已報道紫草素可誘導宮頸癌Hela細胞凋亡[8～10]，但都是從三大經典凋亡通路方面進行研究，而關于紫草素能否通過降低HPV E6、E7基因的表達來達到治療宮頸癌目的的相關研究國內外未見報道。本研究觀察了紫草素對人宮頸癌細胞株Caski增殖、凋亡及HPV E6、E7 mRNA表達的影響，旨在從抗病毒癌基因表達方面研究紫草素的抗宮頸癌作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器 人宮頸癌細胞株Caski購自中國典型培養物保藏中心，貼壁培養于10%胎牛血清的RPMI1640高糖培養基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，每2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞進行后續實驗。紫草素(Calbiochem公司，純度≥98%)，RPMI 1640 細胞培養基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，MTT粉劑(Sigma公司) ，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(Antgene公司) ，4′,6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司),一步法核酸提取試劑盒(Hybribio公司)，逆轉錄試劑(美國Fermentas公司)，PCR引物(上海生工生物有限公司設計并合成)，First Strand cDNA Synthesis Kit (TOYOBO公司)，SYBR Green Real-Time PCR Master Mix(TOYOBO公司)。 Synergy型全自動酶標板分析儀(Bio-Tek公司)，Molecular Imager ChemiDoc XRS + Image Lab 2. 0型成像系統(Bio-Rad公司) ，倒置相差顯微鏡，FACS Calibur型流式細胞測定儀(Becton-Dickinson 公司)， BX51型正置熒光顯微鏡(Olympus公司)，醫用核酸分子雜交儀(Hybribio公司)，熒光定量PCR儀Rotor Gene-6000 (Rotor Gene公司)。

1.2 不同濃度紫草素處理的Caski細胞增殖情況觀察 取對數生長期Caski細胞，制成1×104/mL的細胞懸液，每孔200 μL接種于96孔板，設1～6組，每組6孔，次日分別加入含0、5、10、20、40、80 μmol/L紫草素的RPMI1640培養液，繼續培養12、24、36 h后，采用MTT法觀察各組細胞增殖情況(以OD490表示)。

1.3 不同濃度紫草素處理的Caski細胞凋亡率測算 取對數生長期Caski細胞，制成1×104/mL的細胞懸液，每孔200 μL接種于96孔板，設A～E組，每組6孔，次日分別加入含0、5、10、20、40 μmol/L紫草素的RPMI1640培養液，繼續培養24 h后，收集上清液，用PBS清洗后收集清洗液，再用胰酶消化收集貼壁細胞，要求細胞總數達1×106個，離心后棄上清，PBS清洗一遍，再用500 μL結合緩沖液重懸細胞轉移至流式細胞管，每管中分別加入5 μL Annexin V-FITC染色10 min后再加入10 μL PI 染色10min，用流式細胞儀測算各組細胞凋亡率。

1.4 不同濃度紫草素處理的Caski細胞HPV E6、E7 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。細胞分組及處理同1.3。培養24 h后提取各組細胞RNA，逆轉錄合成cDNA，然后行實時熒光定量PCR擴增。E6上游引物5′-CTGCAATGTTTCAGGACCCA -3′，E6下游引物5′-TCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT -3′，E7 上游 引物5′-GAGGAGGAGGATGAAATAGATGGT -3′，E7下游引物5′-CACTTGCAACAAAACGTTACAATATTG -3′，GAPDH上游引物5′-CTTTGACGCTGGGGCTGGCA -3′，下游引物5′-TGGCAGGGACTCCCCAGCAG -3′。PCR反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15s、60 ℃ 30 s共40個循環。采用2-△△CT表示E6、E7 mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 各組Caski細胞OD490比較 相同培養時間比較1～6組Caski細胞OD490隨紫草素劑量提高逐漸下降(P均<0.05)。

表1 培養12、24、36 h時1～6組Caski細胞OD490比較

2.2 各組Caski細胞凋亡率比較 培養24 h后A、B、C、D、E組細胞凋亡率分別為3.9%±0.2%、9.1%±0.3%、28.9%±0.5%、41.7%±1.2%、88.1%±1.3%、97.17%±0.7%。A～E組Caski細胞凋亡率隨紫草素應用劑量提高逐漸升高(P均<0.05)。

2.3 各組Caski細胞HPV E6、E7mRNA相對表達量比較 培養24 h后各組Caski細胞HPV E6、E7 mRNA相對表達量見表2。培養24 h后A～E組Caski細胞HPV E6、E7 mRNA相對表達量隨紫草素應用劑量提高逐漸升高(P均<0.05)。

表2 各組Caski細胞HPV E6、E7 mRNA相對表達量比較

3 討論

作為婦科最常見惡性腫瘤之一，宮頸癌已對女性的健康構成極大威脅。目前臨床上治療方式主要有手術、放療和化療。晚期宮頸癌患者適合全身性綜合治療[11]，化療是全身性綜合治療中的首選方案，盡管迄今為止宮頸癌化療藥物已取得一定的成績，但明確有效的化療藥仍有限，且價格昂貴，耐藥性也越來越大[12]，因此新藥的研發迫在眉睫。

HPV感染是宮頸癌發病最主要的原因，其致病機理主要與其致癌基因E6、E7通過直接或間接的方式干擾細胞周期、抑制細胞凋亡，從而促使細胞永生化有關。研究發現多種藥物通過影響病毒癌基因的復制、轉錄、翻譯來達到誘導腫瘤細胞凋亡的目的[13]，證實E6、E7是腫瘤治療的重要分子靶點。

細胞凋亡是細胞程序性死亡中獨特的細胞死亡方式，在多種內源性基因調控下，細胞產生的生理或自然死亡過程是細胞凋亡[14～16]。細胞凋亡在維護機體生理穩態、應答DNA損傷、抑制細胞增殖等方面起著重要的作用，也是目前生命科學研究中的熱門內容。目前，細胞凋亡與腫瘤的治療有極大的相關性，抗腫瘤藥物的研發主要集中在誘導腫瘤細胞凋亡的層面上[17～20]。紫草素作為近年來新發現的萘醌類化合物，已被證實可從多種途徑抑制多種癌細胞的凋亡[21]。

本研究結果顯示紫草素可抑制宮頸癌Caski細胞的增殖并誘導其凋亡，進一步研究發現紫草素作用宮頸癌Caski細胞后，HPV E6、E7 mRNA表達量下降，提示紫草素誘導宮頸癌Caski細胞凋亡的機制可能與降低E6、E7基因的表達有關。

HPV感染的治療是現代醫學的一個難題。紫草素作為傳統中藥的活性成分，在抗菌、抗腫瘤等方面的研究也取得了一定的成果。本研究首次發現紫草素能誘導宮頸癌Caski細胞凋亡，其機制可能與降低E6、E7基因的表達有關，表明了紫草素在抗HPV相關宮頸癌的優勢，而關于紫草素能否誘導HPV感染的正常細胞和癌前病變細胞凋亡以及降低相關細胞E6、E7基因的表達來發揮抗病毒、抗腫瘤的作用，以早期治療HPV感染并預防宮頸癌的發生發展，仍需進一步研究。

參考文獻：

[1] Grigore M, Dragos L, Matei M, et al. HPV and cervical cancer awareness among HPV vaccinated women[J]. Eur J Obstet, 2016,206(2):155.

[2] Li Y, Rong S, Zhi Y, et al. Detection of cervical intraepithelial neoplasia with HPVE6/E7 mRNA among women with atypical squamous cells of unknown significance[J]. Inter J Gynecol, 2017,137(2):145-149.

[3] KoromilasAE, Li S, Matlashewski G. Control of interferon signaling in human papillomavirus infection[J]. Cytokine, 2001,12(2-3):157-170.

[4] Wang R, Yin R, Zhou W, et al. Shikonin and its derivatives: a patent review[J]. Exp Opin Ther Patent, 2012,22(9):977-97.

[5] Hou Y, Guo T, Wu C, et al. Effect of shikonin on human breast cancer cells proliferation and apoptosis in vitro.[J]. J Pharmaceuti Soci JPN, 2006,126(12):1383-1386.

[6] Yang Q, Ji M, Guan H, et al. Shikonin inhibits thyroid cancer cell growth and invasiveness through targeting major signaling pathways[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2013,98(12):1909-1917.

[7] Chen J, Xie J, Jiang Z, et al. Shikonin and its analogs inhibit cancer cell glycolysis by targeting tumor pyruvate kinase-M2[J]. Oncogene, 2011,30(42):4297-4306.

[8] Wu Z, Wu LJ, Li LH, et al. Shikonin regulates HeLa cell death via caspase-3 activation and blockage of DNA synthesis[J]. J As Natu Prod Res, 2004,6(3):155-166.

[9] Karbalaie Niya MH, Safarnezhad TF, Panahi M, et al. Human Papillomavirus Investigation in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma: Initial Report from the Low Risk HPV Types Associations[J]. Asian Pharmacy, 2017,18(9):2573-2579.

[10] Yu MX, Song XK, Lou JS. Inhibitory Effect of Shikonin on the Proliferation of Human Cervical Carcinoma HeLa Cells and Induction Effect of It on the Apoptosis of HeLa Cells[J]. China Pharmacy, 2013,24(39):3679-3681.

[11] Malfetano J. Concurrent Cisplatin-Based Radiotherapy and Chemotherapy for Locally Advanced Cervical Cancer-NEJM[J]. NEng J Med, 1999,340(15):1144-1153.

[12] Hou Y, Pan J, Kuerban G. [Pathogenic bacterium and drug resistance in cervical cancer patients complicated with reproductive tract infection].[J]. J Centr South Univer, 2016,41(7):721.

[13] Li Y, Li Z. Mitochondria and apoptosis[J]. Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi, 2000,34(3):183-184.

[14] Mirzayans, R, New insights into P53 signaling and cancer cell response to DNA dam-age: implications for cancer therapy [J]. Biomed Biotechnol, 2012,13(4):203-206.

[15] Belmadani A, Kumar S, Schipma M, et al. Inhibition of amyloid-induced neurotoxicity and apoptosis by moderate ethanol preconditioning[J]. Neuroreport, 2016,15(13):2093-2096.

[16] Zamzami N, El HC, Maisse C, et al. Bid acts on the permeability transition pore complex to induce apoptosis[J]. Oncogene, 2017,19(54):6342-6350.

[17] Zhang YM, Chen XZ. Expression of long non-coding RNA HOTAIR in cervical cancer and its effect on proliferation and apoptosis of HeLa cells[J]. Tumor, 2015,35(4):600-602.

[18] Vidya-Priyadarsini R, Senthil-Murugan R, Maitreyi S, et al. The flavonoid quercetin induces cell cycle arrest and mitochondria-mediated apoptosis in human cervical cancer (HeLa) cells through p53 induction and NF-κB inhibition.[J]. Eur J Pharmacol, 2010,649(3):84.

[19] You BR, Hwajin M, Han YH, et al. Gallic acid inhibits the growth of HeLa cervical cancer cells via apoptosis and/or necrosis.[J]. Food, 2010,48(5):1334-1340.

[20] Singh M, Singh N. Curcumin counteracts the proliferative effect of estradiol and induces apoptosis in cervical cancer cells[J]. Molecular, 2011,347(1-2):1-11.

[21] Zhang L, Zhang S. Modulating Bcl-2 family proteins and caspase-3 in induction of apoptosis by paeoniflorin in human cervical cancer cells.[J]. Phytotherapy Research, 2011,25(10):1551-1557.