茶黃素對人宮頸癌細胞株HeLa順鉑敏感性的影響及其機制

劉麗萍,吳宏文 ,王勝

(1貴州理工學院食品藥品制造工程學院,貴陽550003;2南昌大學第一附屬醫院;3貴州醫科大學附屬醫院)

臨床上宮頸癌多采取以手術及放化療為主的綜合性治療[1]，因其具有易發生淋巴轉移、對放療敏感性差以及對化療易耐藥等惡性特征，宮頸癌的治療效果并不理想，預后較差[2]。美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)的宮頸癌治療指南認為，順鉑是宮頸癌治療中最有效的單藥化療藥[3]，而獲得性耐藥的產生嚴重制約了順鉑的臨床應用。因此，尋找能夠增強順便化療療效、改善患者預后的有效途徑，是宮頸癌治療領域的研究熱點。茶葉具有防癌抗癌的功效，兒茶素和茶黃素是主要有效成分[4]，其中茶黃素是決定紅茶品質的主要功能成分，約占茶葉干重的0.3%～2%[5]。近年來的研究證實，茶黃素在肝[6]、肺[7]等人體器官中具有抗炎活性。有研究表明，茶黃素可以抑制腫瘤細胞增殖、轉移和擴散[8]，而關于茶黃素對腫瘤細胞(如宮頸癌等)化療敏感性的影響的研究甚少。本研究觀察了茶黃素對宮頸癌細胞株HeLa順鉑化療敏感性的影響，并初步探討其作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑與儀器 人宮頸癌HeLa細胞株購自中科院上海細胞庫，培養于DMEM培養基中(含10%胎牛血清、105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，取復蘇后4～10代細胞進行試驗。DMEM培養基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，青霉素、鏈霉素、茶黃素以及順鉑(批號：H37021362)購自齊魯制藥有限公司，MTT溶液購自北京雷根生物技術有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購自東莞市華悅科明貿易有限公司，RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，Cleaved Caspase 3 (ab183179)、Cleaved Caspase 9 (ab135544)、PARP (ab4830)、p-IκB (ab107637)、p-NFκB (ab32360)和p-Akt (ab8933)抗體均購自美國Abcam公司，羊抗兔、兔抗鼠二抗購自上海恒遠生物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒、ECL發光液購自美國Thermo公司；酶標儀(ELx800)購自美國BioTek公司，凝膠成像儀(GelDoc2000)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 茶黃素對順鉑HeLa細胞半數抑制濃度(IC50)的影響觀察 取對數生長期HeLa細胞，以0.8×104/孔的密度接種于96孔板，細胞貼壁后換成無血清DMEM培養液，撤血清24 h，使細胞周期同步化。設觀察1～9組和對照1～9組，每組3個復孔。對照1～9組細胞分別加入0、5、10、15、20、25、30、35、40、50 μg/mL的順鉑繼續培養24 h。觀察1～9組先加入10 μg/mL的茶黃素，再分別加入0、5、10、15、20、25、30、35、40、50 μg/mL順鉑繼續培養24 h。采用MTT法觀察各組增殖情況：每孔加10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，孵育4 h，棄掉上清，每孔加150 μL的DMSO，振蕩、溶解，于酶標儀上測量490 nm波長吸光度值(OD490)。計算各組細胞存活率，即加藥組吸光度值與未加藥組吸光度值的比值百分比。SPSS13.0統計軟件計算觀察組和對照組HeLa細胞順鉑IC50。

1.3 茶黃素對HeLa細胞凋亡相關蛋白Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP及NF-κB信號通路相關蛋白p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt表達影響觀察 取對數生長期HeLa細胞，以0.8×104/孔的密度接種于96孔板。設對照組、順鉑組、茶黃素組和聯合組，每組3個復孔。對照組細胞不加藥，順鉑組加入10 μg/mL的順鉑，茶黃素組加入10 μg/mL的茶黃素，聯合組加入10 μg/mL的順鉑和茶黃素。繼續培養24 h后采用Western blotting法檢測Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP、p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt蛋白。具體方法為收集各組約1×107個細胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。8% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白后，濕轉法將蛋白轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉1h，TBS-T洗膜，分別加入Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP、p-IκB、p-NFκB和p-Akt和內參GAPDH的一抗，4 ℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，加入HRP標記的羊抗兔或兔抗鼠二抗，室溫孵育1 h，加ECL發光液進行化學發光顯影，凝膠成像儀對蛋白條帶進行觀察，獲取圖像，并對圖像進行灰度分析(Image Lab軟件)，記錄各條帶灰度值。以目的蛋白與內參照蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 觀察組、對照組HeLa細胞順鉑IC50對照1～9組HeLa細胞存活率分別為102.54%±4.21%、98.32%±2.46%、96.11%±3.64%、90.36%±3.91%、86.29%±3.17%、81.46%±3.61%、78.92%±4.18%、70.63%±4.25%、63.28%±4.21%，HeLa細胞順鉑IC50為25 μg/mL。 觀察1～9組HeLa細胞存活率分別為102.54%±4.21%、80.21%±3.82%、78.92%±4.24%、77.93%±3.95%、68.26%±3.24%、50.36%±4.29%、45.32%±4.74%、40.25%±3.21%、35.37%±3.16%，HeLa細胞順鉑IC50為10 μg/mL。

2.2 各組HeLa細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP、p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt蛋白表達比較 各組HeLa細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP、p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt蛋白相對表達量見表1。順鉑組、茶黃素組、聯合組細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP相對表達量均高于對照組(P均<0.05)，聯合組細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP相對表達量均高于順鉑組、茶黃素組(P均<0.05)。順鉑組、對照組細胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相對表達量相比P>0.05，茶黃素組細胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相對表達量高于對照組(P均<0.05)，聯合組細胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相對表達量高于順鉑組和茶黃素組(P均<0.05)。

表1 各組HeLa細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP、p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt蛋白相對表達量比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與順鉑組相比，#P<0.05；與茶黃素組相比，ΔP<0.05。

3 討論

全球每年宮頸癌的新發病例約50萬，死亡病例約27萬[8,9]。我國是宮頸癌的高發區，其發病率居高不下，且有逐年增加的趨勢，患病人群向年輕化發展，每年宮頸癌的死亡病例數高達5萬。宮頸癌已成為威脅我國女性健康的一大殺手，嚴重影響了女性的生活質量和生命健康[10]。順鉑是一類小分子鉑類抗癌藥，其作用靶點為腫瘤細胞的DNA，能夠引起細胞DNA損傷進而導致細胞凋亡，順鉑的抗癌作用強且抗癌譜廣[11]，而DNA損傷的同時也激活了DNA的修復機制，使順鉑殺傷細胞的能力下降，從而產生藥物的耐藥[12]。此外，順鉑的不良反應多且嚴重，如骨髓抑制、耳腎毒性等[13]，以上因素限制了順鉑的臨床應用。植物素類抗腫瘤藥的抗瘤活性強且不良反應輕微，茶葉中有效成分多酚類化合物(茶多酚)被廣泛用于保健品。體外研究結果表明，茶多酚能夠誘導腫瘤細胞凋亡和細胞周期阻滯，但并不影響正常健康細胞[14]。茶黃素是一類能溶于乙酸乙酯的茶多酚，具有多種與人體健康相關的潛在功效，如抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、防治心血管疾病等[15]。近年來關于茶黃素抗癌防癌作用的相關研究結果顯示，茶黃素主要是通過抗氧化、促進腫瘤細胞凋亡等途徑發揮作用，Prasad等[16]發現，茶黃素能夠誘導細胞周期蛋白激酶抑制因子p21waf1/cip1表達，抑制細胞周期蛋白B(Cyclin B)表達，進而導致G2/M期阻滯，誘導細胞凋亡。

本研究結果顯示單獨采用順鉑的對照組HeLa細胞順鉑IC50值為25 μg/mL，而聯合應用10 μg/mL 茶黃素的觀察組HeLa細胞順鉑IC50值降低至10 μg/mL，提示茶黃素增強了HeLa細胞對順鉑的敏感性。

為了研究茶黃素提高HeLa細胞對順鉑的敏感性的機制，本研究進一步觀察了茶黃素對HeLa細胞凋亡相關蛋白Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP表達的影響，結果顯示順鉑組、茶黃素組、聯合組細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP相對表達量均高于對照組，聯合組細胞Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9、PARP相對表達量均高于順鉑組、茶黃素組。表明茶黃素增強了順鉑誘導HeLa細胞細胞凋亡的能力。

多項研究證實，NF-κB信號通路介導了腫瘤細胞的多藥耐藥(MDR)的發生[17, 18]，一般情況下，NF-κB與IκB結合，以無活性狀態存在于細胞質中；當細胞受到刺激時，IκB發生磷酸化等級聯反應，使得NF-κB核易位，調控下游靶基因表達(如MDR1等)[19]。NF-κB和Akt的連續激活被認為介導了化療藥物耐藥性，阻滯了DDP介導的細胞凋亡[20]。本研究觀察了茶黃素對HeLa細胞NF-κB信號通路相關蛋白p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt表達的影響，結果顯示，順鉑組、對照組細胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相對表達量相比P>0.05，茶黃素組細胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相對表達量高于對照組(P均<0.05)，聯合組細胞p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt相對表達量高于順鉑組和茶黃素組(P均<0.05)。表明順鉑對HeLa細胞NF-κB信號通路相關蛋白p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt表達無明顯影響，但茶黃素可以降低HeLa細胞NF-κB信號通路相關蛋白p-IκBα、p-NF-κB和p-Akt表達，這可能是茶黃素增強順鉑誘導的HeLa細胞凋亡進而增加HeLa細胞順鉑敏感性的機制。

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