甘草查爾酮A對卵巢癌細(xì)胞株HO8910增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

仇小敏,王佳賀

(1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052;2中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院)

卵巢癌為中老年女性常見惡性腫瘤之一，病死率較高[1,2]。化療是目前治療卵巢癌的主要方案，但是卵巢癌對化療藥物的耐藥及其很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力嚴(yán)重地降低了卵巢癌患者的生存率[3～5]。因此尋找卵巢癌耐藥的分子靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。甘草查爾酮A是甘草根部的主要活性提取物查爾酮的主要活性成分。研究發(fā)現(xiàn)甘草查爾酮A對多種腫瘤細(xì)胞均有抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用[6～8]。但關(guān)于其對卵巢癌細(xì)胞的作用及可能的作用機(jī)制方面的研究目前仍較少。本研究觀察了甘草查爾酮A培養(yǎng)的HO8910細(xì)胞增殖、凋亡情況，半胱天冬蛋白酶激活劑 (Smac)、X連鎖凋亡抑制蛋白 (XIAP) 表達(dá)情況及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (Caspase-3) 活性的變化，探討甘草查爾酮A對HO8910細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其可能作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和設(shè)備 人卵巢癌細(xì)胞株HO8910由中國醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。細(xì)胞培養(yǎng)試劑和小牛血清購于美國Invitrogen公司；移液器、離心機(jī)(購自德國 Eppendorf 公司)；流式細(xì)胞儀(購自美國貝克曼公司)；XIAP、Smac、β-actin蛋白表達(dá)檢測試劑盒，MTT、Annexin V FITC /PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司。Caspase-3活性檢測試劑盒購于美國Santa Cruz公司。

1.2 HO8910細(xì)胞分組及 甘草查爾酮A應(yīng)用 將HO8910細(xì)胞放在含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液。設(shè)觀察1、2、3組和對照組，每組5孔。觀察1、2、3組分別加入終濃度為20、40、80 μmol/L的甘草查爾酮A，對照組只加培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 各組細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT法。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后收集各組細(xì)胞，棄上清，加入20 μL MTT，37℃繼續(xù)孵育4 h后棄上清。每孔加入DMSO 150 μL吹打混勻，用酶標(biāo)儀檢測光密度值(OD值)。增殖抑制率=(對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 各組細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)和Annexin V-FITC/PI雙染法。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后收集各組細(xì)胞，用冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，2 000 r/min離心后收集細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度至106/mL，加入60 μL的緩沖液重懸后依次加入5 μL的Annexin V、5 μL的PI輕輕搖勻，于常溫下避光15 min，用流式細(xì)胞儀測算細(xì)胞凋亡率。

1.5 各組細(xì)胞XIAP、Smac蛋白檢測 采用Western blotting 法。。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，胰酶消化，離心提取總蛋白，BCA 法測蛋白總濃度，行SDS-PAGE，300 mA轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，然后用5%封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)室溫下封閉2 h，TBST洗滌3次，每次5 min 。加入一抗(用1∶1 000 PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部)，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3次，每次5 min； 加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶6 000稀釋)，室溫孵育1 h；TBST 洗膜3次，每次5 min。加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶，在凝膠成相儀上照相。同時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參照。以XIAP、Smac蛋白條帶和β-actin條帶灰度值之比表示XIAP、Smac蛋白相對表達(dá)量。

1.6 各組細(xì)胞Caspase-3活性檢測 收集各組細(xì)胞并裂解，冰上孵育10 min，4 ℃下12 000 r/min離心10～15 min，收集上清液，按照Caspase-3酶活性試劑盒操作。在熒光計(jì)數(shù)儀上測定熒光的量。通過測定已知不同數(shù)目細(xì)胞的熒光量作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各孔中的活細(xì)胞數(shù)。酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)(100 μL的比色皿)在405 nm或400 nm波長處測定吸光度值(OD值)，以O(shè)D誘導(dǎo)劑/OD對照表示觀察1、2、3組Caspase-3活性。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞OD值比較 繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h各組細(xì)胞OD值見表1。培養(yǎng)24 h對照組和觀察1、2、3組細(xì)胞增殖抑制率分別為0、8.53%、14.14%、26.11%，培養(yǎng)48 h時(shí)分別為0、11.97%、18.36%、33.52%，培養(yǎng)72 h時(shí)分別為0、25.71%、37.62%、51.94%。相同培養(yǎng)時(shí)間情況下，隨著甘草查爾酮A濃度的提升，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高(P均<0.05)。甘草查爾酮A濃度不變的情況下，細(xì)胞增殖抑制率隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸升高(P均<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h各組細(xì)胞凋亡率見表2。相同培養(yǎng)時(shí)間情況下，隨著甘草查爾酮A濃度的提升，細(xì)胞凋亡率逐漸升高(P均<0.05)。甘草查爾酮A濃度不變的情況下，細(xì)胞凋亡率隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸升高(P均<0.05)。

表1 培養(yǎng)24、48、72 h各組細(xì)胞OD值比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

表2 培養(yǎng)24、48、72 h各組細(xì)胞凋亡率比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞XIAP和Smac蛋白相對表達(dá)量比較 繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h各組細(xì)胞XIAP和Smac蛋白相對表達(dá)量見表3。相同培養(yǎng)時(shí)間情況下，隨著甘草查爾酮A濃度的提升，XIAP蛋白相對表達(dá)量逐漸降低(P均<0.05)，Smac蛋白相對表達(dá)量逐漸升高(P均<0.05)。甘草查爾酮A濃度不變的情況下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，XIAP蛋白相對表達(dá)量逐漸降低(P均<0.05)，Smac蛋白相對表達(dá)量逐漸升高(P均<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞Caspase-3活性比較 繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h各組細(xì)胞Caspase-3活性見表4。相同培養(yǎng)時(shí)間情況下，隨著甘草查爾酮A濃度的提升，細(xì)胞Caspase-3活性逐漸升高(P均<0.05)。甘草查爾酮A濃度不變的情況下，細(xì)胞Caspase-3活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸升高(P均<0.05)。

表3 培養(yǎng)24、48、72 h各組細(xì)胞XIAP和Smac蛋白相對表達(dá)量比較

注：

表4 培養(yǎng)24、48、72 h各組細(xì)胞Caspase-3蛋白比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

卵巢癌是指來源于卵巢的惡性腫瘤，其發(fā)病率及病死率呈逐年上升的趨勢[6～8]。目前臨床上用于治療卵巢癌的化療藥物不良反應(yīng)大，且易產(chǎn)生獲得性耐藥，導(dǎo)致卵巢癌化療失敗、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移常見[9,10]。因此，探索增進(jìn)化療藥物的療效、減少化療藥物不良反應(yīng)的方法，是降低病死率、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[11]。甘草查爾酮A大量分布于甘草根莖中，目前研究證實(shí)其具有抗腫瘤、抗炎、抗菌及免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種藥理活性，其中尤以抗腫瘤作用最受關(guān)注。甘草查爾酮A抗腫瘤的機(jī)制主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但關(guān)于其是否能夠誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的研究尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，甘草查爾酮A可劑量和時(shí)間依賴的抑制HO8910細(xì)胞增殖、促進(jìn)HO8910細(xì)胞凋亡，填補(bǔ)了這一空白。

凋亡抑制蛋白(IAPs)家族是一類在結(jié)構(gòu)上具有同源性的蛋白，且與腫瘤的關(guān)系密切[12]。XIAP 是IAP 家族的一員，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[13]。Smac是一種能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的線粒體蛋白，主要通過與IAP 家族成員相互作用促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14～16]。XIAP是人類抑制凋亡基因家族中作用最強(qiáng)的成員，通過與Caspase-3結(jié)合使其喪失活性而阻止細(xì)胞凋亡[17,18]。本研究結(jié)果顯示，甘草查爾酮A可以計(jì)量和時(shí)間依賴的下調(diào)XIAP蛋白、上調(diào)Smac蛋白并增強(qiáng)Caspase-3活性，筆者認(rèn)為這可能是甘草查爾酮A可劑量和時(shí)間依賴的抑制HO8910細(xì)胞增殖、促進(jìn)HO8910細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1] Cai M, Hu HZ, Liu JJ, et al. Beclin 1 Expression in Ovarian Tissues and Its Effects on Ovarian Cancer Prognosis[J]. Int J Mol Sci, 2014,15(4):5292-5303.

[2] Li L, Huang K, You Y, et al. Hypoxia-induced miR-210 in epithelial ovarian cancer enhances cancer cell viability via promoting proliferation and inhibiting apoptosis[J]. Int J Oncol, 2014,44(6):2111-2120.

[3] Stine JE, Guo H, Sheng XG, et al. The HMG-CoA reductase inhibitor, simvastatin, exhibits anti-metastatic and anti-tumorigenic effects in ovarian cancer[J]. Oncotarget, 2016,7(1):946-960.

[4] Lum E, Vigliotti M, Banerjee N, et al. Loss of DOK2 induces carboplatin resistance in ovarian cancer via suppression of apoptosis.[J]. Gynecol Oncol, 2013,130(2):369-376.

[5] Liu J, Li J, Zhang JF, et al. Combination of Fenretinide and Selenite Inhibits Proliferation and Induces Apoptosis in Ovarian Cancer Cells[J]. Int J Mol Sci, 2013,14(11):21790-21804.

[6] Tsai JP, Hsiao PC, Yang SF, et al. Licochalcone A Suppresses Migration and Invasion of Human Hepatocellular Carcinoma Cells through Downregulation of MKK4/JNK via NF-κB Mediated Urokinase Plasminogen Activator Expression[J]. PLoS One, 2014,9(1):86537.

[7] Ming LG, Jin F, Huang P, et al. Licochalcone A up-regulates of FasL in mesenchymal stem cells to strengthen bone formation and increase bone mass[J]. Sci Rep, 2014,4(3):7209.

[8] Park MR, Kim SG, Cho IA, et al. Licochalcone-A induces intrinsic and extrinsic apoptosis via ERK1/2 and p38 phosphorylation-mediated TRAIL expression in head and neck squamous carcinoma FaDu cells[J]. Food Chem Toxicol, 2015,77(5):34-43.

[9] Gao Y, Shen J, Choy E, et al. Inhibition of CDK4 sensitizes multidrug resistant ovarian cancer cells to paclitaxel by increasing apoptosiss[J]. Cell Oncol, 2017,40(3):209-218.

[10] Ma YF, Liu T, Song X, et al. Siva 1 inhibits proliferation, migration and invasion by phosphorylating Stathmin in ovarian cancer cells.[J]. Oncol Lett, 2017,14(2):1512-1518.

[11] Zhu PF, Ning YX, Yao LQ, et al. The proliferation, apoptosis, invasion of endothelial-like epithelial ovarian cancer cells induced by hypoxia[J]. Res CancerJ Exp Clin, 2010,29(7):124.

[12] Liu S, Zhang PP, Chen Z, et al. MicroRNA‐7 downregulates XIAP expression to suppress cell growth and promote apoptosis in cervical cancer cells[J]. FEBS Lett, 2013,587(14):2247-2253.

[13] Xie YL, Tobin LA, Camps J, et al. MicroRNA-24 regulates XIAP to reduce the apoptosis threshold in cancer cells[J]. Oncogene, 2013,32(19):2442-2451.

[14] Ramachandiran S, Cain J, Liao A, et al. The Smac mimetic RMT5265.2HCL induces apoptosis in EBV and HTLV-I associated lymphoma cells by inhibiting XIAP and promoting the mitochondrial release of cytochrome C and Smac[J]. Leuk Res, 2012,36(6):784-790.

[15] Allensworth JL, Sauer SJ, Lyerly HK, et al. Smac mimetic Birinapant induces apoptosis and enhances TRAIL potency in inflammatory breast cancer cells in an IAP-dependent and TNF-α-independent mechanism[J].Res Treat. Cancer Breast, 2013,137(2):359-371.

[16] Sulaiman MK, Chu ZT, Blanco VM, et al. SapC-DOPS nanovesicles induce Smac- and Bax-dependent apoptosis through mitochondrial activation in neuroblastomas[J]. Mol Cancer, 2015,14(3):78.

[17] Eckhardt I, Weigert A, Fulda S. Identification of IRF1 as critical dual regulator of Smac mimetic-induced apoptosis and inflammatory cytokine response[J]. Cell Death Dis, 2014,5(2):1562.

[18] Hamacher-Brady A, Choe SC, Krijnse-Locker J, et al. Intramitochondrial recruitment of endolysosomes mediates Smac degradation and constitutes a novel intrinsic apoptosis antagonizing function of XIAP E3 ligase.[J]. Cell Death Differ, 2014,21(12):1862-1876.