EB病毒LMP1 C端重組蛋白多克隆抗體的制備和鑒定

毛珊珊，王路得，周萌，呂開績，朱進順，Kamara Saidu，葉曉鮮，張麗芳

（溫州醫科大學 分子病毒與免疫研究所 病原生物與免疫學系，浙江 溫州 325035）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）屬于人類γ皰疹病毒科，廣泛存在于人群中，且主要以潛伏感染的形式存在。EBV感染與某些腫瘤的發生和發展密切相關，如伯基特淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma，BL）、霍奇金?。℉odgkin’s lymphoma，HL）、鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）等[1]，且與某些自身免疫性疾病的發病也密切相關，如系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）[2]。EBV在潛伏感染的過程中表達3種潛伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP），包括LMP1、LMP2A和LMP2B。其中，LMP1為66 kDa的跨膜蛋白，是由386個氨基酸組成的功能蛋白，在細胞膜上可形成多次跨膜，其N端的1～23和C端的187～386均游離于胞漿區，具有生物學意義[3]。EBV LMP1的N端在維持B細胞激活、轉化及免疫調節上起作用，而胞

漿區的187～386段，即EBV LMP1 C端，是LMP1的功能區域，在EBV誘導細胞發生轉化的過程中發揮著重要作用。本研究選取了C端的200個氨基酸（187～386）作為研究對象，通過原核表達的方式制備了EBV LMP1 C端重組蛋白及其兔多克隆抗體，并檢驗其生物學特性。

1 材料和方法

1.1 材料E.coliBL21（DE3）感受態細菌購自美國Invitrogen公司；鼻咽癌細胞株C666-1、CNE-2Z、人黑色素瘤細胞株A375均由本實驗室保存；1 kb DNA marker、DL2000 DNA marker、限制性內切酶NdeI和XhoI購自美國NEB公司；鎳螯合親和層析膠（Ni-NTA Agarose）購自德國Qiagen公司；異丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）購自上海杰瑞生物有限公司；His-tag單克隆鼠源抗體、HRP Goat anti-Mouse IgG（H+L）抗體、HRP Goat anti-Rabbit IgG（H+L）抗體、ECL化學發光液均購自杭州聯科生物技術股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pET21a（+）/EBV LMP1 C端重組質粒構建及測序分析：對LMP1 C端進行密碼子優化，送杭州擎科梓熙生物公司全基因合成，將公司合成的LMP1 C端基因構建到pET21a（+）載體，并轉入E.coliBL21（DE3）感受態細菌中，挑取單個的菌落接種到含有氨芐青霉素的LB培養基中，提取的質粒進行酶切和測序鑒定。

1.2.2 pET21a（+）/EBV LMP1 C端重組蛋白表達、純化及鑒定：將測序正確的陽性質粒轉化E.coliBL21（DE3）感受態細菌中，接種于LB液體培養基中，37 ℃，250 r/min培養至菌液OD600=0.6～0.8；加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，250 r/min，37 ℃恒溫振蕩培養6 h；利用高速離心機收集菌液；PBS溶解后超聲裂解細菌，并12000 r/min離心10 min，收集上清；經鎳螯合親和層析膠純化重組蛋白，收集得到LMP1 C端重組蛋白；經SDS-PAGE分析；用His-Tag mAb為一抗，HRP Goat anti-Mouse IgG（H+L）為二抗，進行Western blot分析和鑒定。

1.2.3 EBV LMP1 C端兔多克隆抗體的制備：取4只白兔隨機分為2組，用于免疫EBV LMP1 C端蛋白和PBS；免疫蛋白前，對大耳白兔于耳緣靜脈采血，將樣品作為0周對照組；以500 μg/只的量于第1、第3、第5周依次進行背部皮下多點注射；初次免疫EBV LMP1 C端重組蛋白與完全弗氏佐劑以1∶1（V∶V）的比例混合乳化，第2、第3次免疫時換為不完全弗氏佐劑，并在第2、第4、第6周耳緣靜脈取血；第8周進行心臟取血，37 ℃水浴1 h后于預冷的超速離心機中，4 ℃，4000 r/min離心20 min，收集上層血清，低溫保存備用。

1.2.4 EBV LMP1 C端兔多克隆抗體與重組蛋白結合的特異性檢測：LMP1 C端蛋白經SDS-PAGE后轉膜，用一抗稀釋液以1∶5000稀釋兔多克隆抗體，HRP標

記的山羊抗兔二抗進行免疫印跡反應，ECL顯色。

1.2.5 EBV LMP1 C端兔多克隆抗體反應及效價檢測：用包被緩沖液稀釋LMP1 C端蛋白，以終濃度10 μg/mL包被ELISA板，PBS免疫血清作為對照組；0.3 g/mL脫脂牛奶封閉；0、2、4、6、8周兔血清作為一抗；1∶10000稀釋的HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）為二抗；TMB顯色，H2SO4終止；酶標儀讀

取450～630 nm處吸光值讀數。用ELISA方法檢測

免疫8周后血清抗體效價，將8周血清分別倍比稀為1∶40、1∶160、1∶640、1∶2560、1∶10240、1∶40960、1∶163840、1∶655360，所有血清標本均重復3孔，讀取450～630 nm處吸光值讀數。

1.2.6 EBV LMP1 C端兔多克隆抗體特異性識別天然EBV LMP1蛋白：將C666-1、CNE-2Z、A375細胞以104個/孔接種于細胞爬片上，置于4%多聚甲醛37 ℃固定10 min；0.3% triton x-10037 ℃孵育10 min；PBST洗3次，置于搖床上清洗，每次3 min；用5%山羊血清，置于37 ℃封閉90 min。取出6孔板，加入PBST，每孔2 mL，于搖床上清洗3 min；加入兔抗EBV C端蛋白多克隆抗體（1∶5000稀釋），4 ℃孵育過夜；PBST洗3次；用FITC標記的羊抗兔二抗IgG（H+L）（1∶2000），避光37 ℃孵育1 h；PBST洗3次；避光加入RNA酶（1∶100）和PI（1∶1000）避光染色5 min；避光PBST洗3次；顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 pET21a（+）/EBV LMP1 C端重組質粒的鑒定

用NdeI和XhoI限制性內切酶對重組質粒pET21a（+）/EBV LMP1 C端進行酶切，得到一條約600 bp的條帶（見圖1）；選取陽性菌株送公司測序分析，經Blast比對，重組序列與目的片段完全一致。

2.2 pET21a（+）/EBV LMP1 C端重組質粒的原核表達、純化及鑒定 培養含有pET21a（+）/EBV LMP1 C端重組質粒的BL21（DE3）大腸桿菌，收集加入和未加入IPTG誘導表達的樣品及純化后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分析，在27 kDa處出現單一的蛋白條帶（見圖2A）。His-Tag mAb抗為一抗（1∶10000）進行Western blot分析，在27 kDa處可見陽性反應條帶（見圖2B）。

1：1 kb DNA marker；2：pET21（+）；3：pET21a（+）/EBV LMP1 C端+Nde I；4：pET21a（+）/EBV LMP1 C端+Nde I+Xho I；5：DL 2000 DNA marker

圖2 EBV LMP1 C端蛋白表達及純化的SDS-PAGE電泳（A）和Western blot分析（B）

2.3 EBV LMP1 C端特異性兔多克隆抗體反應及效價 采用ELISA方法對以重組蛋白LMP1 C端為抗原得到的兔血清抗體進行檢測。重組蛋白包被酶標板，0、2、4、6、8周兔多克隆抗體作為一抗，結果顯示，LMP1 C端重組蛋白免疫的白兔在第2周開始產生特異性抗體，至第8周達到高峰（見圖3A）。取8周時血清做抗體稀釋滴度檢測，結果顯示，LMP1 C端兔多克隆抗體的效價可達1∶40000（見圖3B）。

圖3 EBV LMP1 C端重組蛋白免疫兔血清抗體反應（A）及效價分析（B）

2.4 EBV LMP1 C端兔多克隆抗體特異性結合重組蛋白的檢測 利用Western blot方法對獲得的兔多克隆抗體與LMP1 C端蛋白結合和識別的特異性進行檢測分析，以第8周兔多克隆抗體為一抗（1∶5000），在相對分子質量27 kDa處可見特異性陽性條帶（見圖4）。

圖4 兔血清EBV LMP1 C端Western blot分析

2.5 EBV LMP1 C端兔多克隆抗體特異性識別天然EBV LMP1蛋白 選擇EBV LMP1表達陽性的鼻咽癌細胞C666-1、CNE-2Z細胞株作為實驗組，同時選取LMP1表達陰性的人黑色素瘤細胞株A375作為對照組，用以檢測EBV LMP1 C端蛋白多克隆抗體與鼻咽癌腫瘤細胞中天然表達的LMP1特異性識別和結合的能力。結果顯示，EBV LMP1 C端多克隆抗體能夠在C666-1和CNE-2Z的胞漿中，與LMP1特異性結合，表現為數個團塊狀綠色熒光，而A375細胞中未見明顯的綠色熒光（見圖5）。結果表明，EBV LMP1 C端蛋白兔多克隆抗體能夠特異性識別細胞中天然表達的LMP1蛋白。

3 討論

圖5 LMP1 C端兔血清多克隆抗體特異性免疫熒光鑒定（×400）

EBV LMP1 C端是游離于胞漿區的200個氨基酸，含有3個功能結構域，即C末端活化區域（C-termina1 activation region，CTAR）1、CTAR2和CTAR3，這3個結構域提供了信號分子對接蛋白的結合位點，如TNFR相關因子（TNFR-associated factors，TRAFs）、TNFR相關死亡結構域（TNFR-associated death domain，TRADD）、受體相互作用蛋白激酶（receptor interacting protein kinase，RIP）和BS69等，通過NF-κB、p38-MAPK、PI3-K/Akt、ERKMAPK和JAK/STAT等信號通路轉導細胞信號[4-7]。從而產生促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、增強細胞遷移等多種生物學作用[8-9]。如C端功能區的CTRA1和CTAR2可直接與TNFRs蛋白或TRADD結合，從而激活NF-κB的活性，促進細胞增生[10-11]；CTAR3通過募集JAK3，進而活化STAT3[12]。因此，EBV LMP1 C端的187～386氨基酸序列在EBV誘導細胞轉化和癌變過程中發揮重要作用。

通過原核表達制備靶蛋白，是研究靶蛋白生物學作用的重要途徑之一。目前研究表明，EBV LMP1可通過原核表達制備重組蛋白，對其生物學功能進行研究，用于原核表達的載體主要包括pET32a載體和PGEM-T載體[13-15]，但這些載體表達的融合蛋白攜帶有載體本身蛋白，而載體蛋白對實驗結果會產生一定的干擾作用。為此，本研究設計了起始密碼子后的第1個密碼子即為目的蛋白翻譯的起始密碼子，利用pET21a載體系統獲得的蛋白即為全長目的蛋白，即LMP1 C端蛋白，從而避免了載體成分對實驗結果的影響。經過免疫日本大耳白兔制備的抗體具有效價高的特點，利用Western blot和免疫熒光分析，該蛋白可特異性識別EBV LMP1蛋白，表明本研究制備的EBV LMP1 C末端蛋白具有較強的免疫原性和抗原性。

目前，商業化的EBV LMP1單克隆抗體主要有下列幾種，即能識別位于LMP1 C端的多個抗原表位的單克隆抗體混合而成的抗體（CS1、CS2、CS3、CS4），可識別20種地理位置上不同的EBV分離株（CS 1～4）及可識別EBV LMP1 C末端Asp293-Asp312位點的單克隆抗體（D24-G）。但上述單克隆抗體仍然有一些問題存在，如針對的抗原表位有限且成本昂貴。多克隆抗體則由于識別譜廣，制備簡單方便，且經濟實惠，在免疫學檢測及實驗中具有較為廣泛的應用前景。本研究通過LMP1 C端蛋白制備的兔多克隆抗體，可特異性識別LMP1的C末端，且效價高，特異性強，可為EBV LMP1的基礎研究和臨床應用提供依據。

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