一起規模豬場胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

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(浙江省動物疫病預防控制中心，浙江 杭州 310018)

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)是豬胸膜肺炎的病原菌，為一種革蘭氏陰性、有莢膜、具有典型球桿菌形態的小桿菌。根據是否需要NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)，將其分為生物I型(依賴于NAD)和生物II型(不依賴于NAD)。生物I型在葡萄球菌菌落周圍形成菌落呈“衛星”狀，培養24 h后形成0.5～1 mm菌落，用綿羊血制成的血平板上出現β溶血現象。臨床上引發豬放線桿菌胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumia，PCP)的主要是生物I型，該型細菌有13個血清型(1～12，15)[1-2]。1987年楊旭夫等首次證實了我國存在豬傳染性胸膜肺炎，其后幾年該病在我國的發病率顯著上升，并在我國許多地區呈流行趨勢，對集約化養豬業的發展造成了很大的威脅[3-5]。本次實驗對浙江省杭州市蕭山區某規模豬場發病豬舍的4頭保育豬病料樣品進行細菌分離鑒定，并對分離株進行藥物敏感性試驗，為該豬場有效防控豬病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器設備 TissueLyserⅡ組織勻漿機、Thermo LH11 CO2培養箱、蔡司(ZEISS)Scope.A1顯微鏡、Thermo 1300 SERIES A2生物安全柜、Eppendorf移液器、Eppendorf恒溫混勻儀、Eppendorf 5424離心機、羅氏LightCycler?480Ⅱ實時熒光PCR儀。

1.1.2培養基和試劑 血瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和革蘭氏染色液試劑盒購自青島高科技工業園海博生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線桿菌標準菌株購自中國獸醫藥品監察所；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；Ex Taq酶購自TaKaRa；QIAamp?DNA純化試劑盒-Mini購自QIAGEN；引物和探針由上海生工公司合成。

1.1.3樣本來源 2017年12月13日，采集浙江省杭州市蕭山區某規模豬場4頭發病保育豬的肺臟，分別編號為肺1、肺2、肺3、肺4。

1.2方法

1.2.1細菌分離 無菌操作法切開病變組織，用接種環刮取病料接種于血平板，再用金黃色葡萄球菌作交叉劃線，于37℃、含5% CO2條件下培養24 h。

1.2.2細菌鑒定 于血平板上培養18～24 h，觀察菌落形態。挑取可疑菌落作革蘭氏染色，油鏡下觀察細菌形態及染色情況。

1.2.3V因子需要測定 將可疑菌株純培養物接種于血平板，方法同1.2.1。

1.2.4過氧化氫酶試驗 在潔凈的載玻片上滴1滴3%的H2O2溶液，用接種環挑取適量的可疑菌在H2O2溶液中混勻，觀察是否有氣泡產生。

1.2.5熒光定量PCR檢測 根據Tobias TJ等[6]的方法，合成一對特異性引物及探針。上游：GGG GAC GTA ACT CGG TGA TT，下游：GCT CAC CAA CGT TTG CTC AT，探針：CGG TGC GGA CAC CTA TAT CT。用DNA純化試劑盒提取待檢胸膜肺炎放線桿菌可疑菌株和胸膜肺炎放線桿菌標準菌株核酸分別作為定量PCR的模板和陽性對照。擴增體系：Taq酶0.12 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物各0.2 μL，探針0.2 μL，10×buffer 2 μL，ddH2O 10.28 μL，DNA模板5 μL。按照以下程序進行擴增：95℃預變性2 min；98℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環；72℃延伸5 min。

1.2.6藥敏試驗 按照NCCL推薦的K-B紙片瓊脂擴散法，選用臨床上常用藥物分別對分離純化的菌株進行藥敏試驗。用無菌生理鹽水將待檢菌株制成0.5麥氏單位菌懸液，含菌量在5×107～5×108，用滅菌棉簽拭子浸入細菌懸液中，在管壁擠去多余菌液，然后均勻涂布在90 mmTSA瓊脂平板上，室溫靜止3～5 min后，無菌操作將藥敏紙片均勻貼在上述TSA平板上，37℃ 5% CO2培養48 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，判斷待檢菌株對各種藥物的敏感性[7]。

2 結果

2.1細菌分離結果 肺4分離到胸膜肺炎放線桿菌可疑菌株，編號為ZJYK-01226，其他病料(肺1、肺2和肺3)未發現胸膜肺炎放線桿菌可疑菌落。

2.2細菌形態學檢查結果

2.2.1菌落形態 在血平板培養24 h后，菌落呈露珠樣小菌落，呈β溶血，菌落直徑0.5 mm～1 mm。靠近金黃色葡萄球菌菌苔的菌落較大，隨著與葡萄球菌生長線的距離增加而變小或不生長。

2.2.2細菌形態 涂片作革蘭氏染色后，鏡檢為革蘭氏陰性短小桿菌。

2.3V因子需要測定結果 可疑菌株(ZJYK-01226)在血平板上生長有“衛星現象”，表明該菌株需要V因子(圖1)。

圖1 可疑菌株生長呈“衛星現象”

2.4過氧化氫酶試驗結果 ZJYK-01226菌株過氧化氫酶試驗結果為陽性。

2.5熒光定量PCR檢測結果 對ZJYK-01226菌株進行熒光定量PCR檢測，結果為胸膜肺炎放線桿菌陽性(表1、圖2)。

圖2 ZJYK-01226菌株熒光定量PCR檢測結果

表1 可疑菌株熒光定量PCR檢測結果

綜合分析ZJYK-01226菌株的菌落形態、生長特性、細菌形態學檢查情況和熒光定量PCR檢測結果，可以判定該菌株為胸膜肺炎放線桿菌。

2.6藥敏試驗結果 ZJYK-01226菌株對頭孢噻肟、氟苯尼考、氨曲南、頭孢呋辛、頭孢哌酮等藥物敏感；對復方新諾明、鏈霉素等藥物中敏；對青霉素、卡那霉素、四環素、替米考星耐藥(表2)。

表2 ZJYK-01226菌株藥敏試驗結果

注：S-敏感；I-中介；R-耐藥，不同藥物判定標準不同。

3 討論

胸膜肺炎放線桿菌雖分布廣泛，但且僅感染豬。感染病原主要存在于慢性肺損傷和扁桃體中，很少在鼻腔中分離到。豬群間的傳播主要通過引入攜帶病原的動物，傳播的主要途徑是豬與豬的直接接觸或通過短距離的飛沫傳播。在地方性傳染的畜群中，感染母豬可以通過垂直傳播把該病傳染給后代，傳染的概率可能取決于母豬鼻腔分泌物中的細菌含量和仔豬體內的母源抗體水平。母源抗體可持續2周到2個月[1]。在初次分離胸膜肺炎放線桿菌時，盡量選擇病變的肺臟或扁桃體病料，這樣可以提高分離率。在初分離時利用該菌在血平板上的“衛星現象”特點，選擇可疑菌落是該菌分離的關鍵步驟。

在 PCP的防控中，對沒有感染胸膜肺炎放線桿菌的畜群應嚴格執行生物安全措施，對畜群而言最大的危險是引進潛在的感染豬，應該從沒有發生過胸膜肺炎放線桿菌的地區或血清型陰性的地區引進畜種，新引進的動物應進行隔離和血清學檢測。感染胸膜肺炎放線桿菌的豬場爆發胸膜肺炎時，首先應通過治療控制感染動物的死亡率，繼而通過控制環境因素、實行全進全出制度、較早的斷奶日齡(少于21 d)等措施，降低發病率，減少損失。

值得注意的是胸膜肺炎放線桿菌也是豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)的病原體之一[8]，該豬場存在PRRS、豬瘟、沙門氏菌、豬圓環病毒2型混合/繼發感染，而胸膜肺炎放線桿菌感染是導致育肥豬群發生急性呼吸道感染爆發的最常見原因。抗生素防治是控制保育階段副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、胸膜肺炎放線桿菌等細菌繼發/混合感染的有效手段，也是防控育成階段豬傳染性胸膜肺炎的有效措施，是減少豬群死淘率的重要措施。由于胸膜肺炎放線桿菌較易產生耐藥性，且不同地區的APP分離株對藥物的敏感性存在一定的差異。本次藥敏試驗結果對該發病豬場選擇敏感藥物提供了依據。

[1] 齊默爾曼(Jeffrey J.Zimmerman)等主編；趙德明等主譯.豬病學(第10版)[M].中國農業大學出版社，2014：681-692.

[2] Reiner G, Fresen C, Bronnert S, Haack I, Willems H. Prevalence of Actinobacilluspleuropneumoniae infection in hunted wild boars (Susscrofa) in Germany [J].J Wildl Dis，2010，46(2):551-555.

[3] 楊旭夫,彭發泉.胸膜肺炎嗜血桿菌的分離和鑒定[J].中國畜禽傳染病,1990(4):1-3.

[4] 謝艷霞,周學利,沈學懷，等.豬傳染性胸膜肺炎在保育豬中的流行病學調查[J].農業災害研究,2016,6(6):52-53.

[5] 郭志英,李郁,吳浩陽,等.豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及其生物學特征的研究[J].中國獸醫科學,2016,46(9):1102-1109.

[6] Tobias TJ, Bouma A,Klinkenberg D,et al. Detection of Actinobacilluspleuropneumoniae in pigs by real-time quantitative PCR for the apxIVA gene[J].Vet J，2012，193(2):557-560.

[7] 張東超，楊寧寧，林靜，等.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫，2016，43(6)：1604-1609.

[8] Fablet C, Marois-Créhan C,Simon G,et al.Infectious agents associated with respiratory diseases in 125 farrow-to-finish pig herds: a cross-sectional study[J]. Vet Microbiol，2012，157(1-2):152-163.