副豬嗜血桿菌的分離鑒定及中藥單體抑菌作用

(福建光華農牧科技開發有限公司，福建 福州 350000)

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)引起的豬多發性漿膜炎和關節炎[1]。目前H.parasuis在世界范圍內廣泛流行，給規模化豬場的生產造成了巨大的經濟損失。副豬嗜血桿菌屬于巴士桿菌科，NAD依賴型、兼性厭氧性、革蘭氏陰性細小桿菌、非溶血性、V因子依賴性、形態多變、無芽孢，是一種條件性致病菌，廣泛存在于豬的呼吸道[2]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病料 福建省福州市某豬場的病豬關節液病料。

1.1.2主要試劑及培養基 胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基 (TSA)、新生牛血清、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD+)、二甲基亞砜(DMSO)、Premix Taq、DNAmarker、瓊脂糖、TAE緩沖液、14種中藥單體標準品等。

1.2方法

1.2.1細菌的分離 在超潔凈工作臺中取出病料，點燃酒精棉球對病料的表面進行火焰滅菌，切開關節腔，用滅菌的接種棒深入關節腔內采集關節液，劃線于事先配制的TSA培養基上，37℃恒溫培養。

1.2.2細菌的純化H.parasuis在含有NAD+及新生牛血清的TSA培養基上生長良好，培養24 h以后用接種棒挑選疑似H.parasuis的單菌落，在新的TSA平板上劃線純化，37℃培養。24 h以后再挑選長勢良好的疑似H.parasuis的單菌落，接種到5 mL的TSB液體培養基中，放入恒溫搖床，37℃、190 rpm振蕩培養12 h后分裝保存，等待下一步的驗證。

1.2.3細菌DNA的提取 取1 mL事先保存的細菌培養液于1.5 mL離心管中，10000 rpm離心5 min，棄去上清液，加入500 μL的ddH2O，100℃煮沸10 min。再放入冰塊中冰浴5 min，10000 rpm離心5 min，取上清液裝入新的EP管內，-20℃保存備用。

1.2.4PCR鑒定 取疑似副豬嗜血桿菌菌液，作為PCR模板，在25 μL反應體系中加入Premix Taq 12.5 μL，模板DNA 1 μL，引物1.5 μL(P1、P2、P3各0.5 μL)，ddH2O 10 μL，瞬時離心混勻。然后在PCR儀中運行以下程序：95℃預變性5 min；94℃變性45 s；56℃退火45 s；72℃延伸50 s 35個循環，72℃延伸10 min。將PCR的產物點樣于1%瓊脂糖凝膠孔中，120 V、120 A電泳20 min后，置于凝膠成像儀中觀察，并做好記錄。

1.2.5各種中藥對H.parasuis的最小抑菌濃度(MIC)測定 用高壓滅菌的10 μL槍頭挑取長勢良好的單菌落，轉接至TSB液體培養基中，37℃、190 rpm振蕩過夜培養。利用紫外分光光度計測量菌液OD600處的吸光度。用TSB肉湯稀釋，將菌液的吸光度值調節0.5個麥氏比濁。在使用前，再將菌液稀釋10倍(菌液濃度為1×107CFU/mL)。在無菌條件下，向96孔板的第一列加入190 μL TSB液體培養基,其他各孔加入100 μL TSB液體培養基。然后往第一列中分別加入10 μL濃度為5120 μg/mL的藥品儲備液，使其終濃度為256 μg/mL。吹打混勻以后，從第一列吸取100 μL液體到第二列中，再次吹打混勻，這樣依次倍比稀釋至第10號孔，吹打混勻后棄去100 μL液體。第11和第12號孔暫不做處理。蓋上蓋子后放入37℃恒溫箱中培養。分別在培養12 h和24 h時取出試管，在無菌條件下用接種環取一些菌液在TBA固體培養基上劃線，再放入恒溫箱中培養48 h。觀察細菌是否生長，以細菌不生長的最小濃度作為最小殺菌濃度。

2 結果

2.1細菌菌落形態 從臨床采集病料中分離到的H.parasuis菌株，經過純化后的菌株在含有新生牛血清和NAD+的TSA瓊脂平板上呈現為光滑濕潤，透明或者灰白色、露珠或者針尖狀大小的菌落。如圖1所示。

圖1 副豬嗜血桿菌形態

2.2PCR鑒定結果 根據H.parasuis的16S rRNA基因的保守序列設計引物，將分離到的疑似H.parasuis的菌株進行PCR擴增，所得產物的大小為1028 bp。結果證明所分離到菌株有4株為H.parasuis。

M：DL2000 DNAmarker；陽性：陽性對照；1、2、3、4：檢測樣品。圖2 16S rRNA凝膠電泳圖

2.3中藥單體對H.parasuis分離株的最小抑菌濃度(MIC) 14種中藥單體對H.parasuis的最小抑菌濃度結果如表1。

3 討論

近年來，豬群對抗生素的依賴性不斷增加，研究發現已經出現對青霉素、氨芐西林、頭孢菌素、慶大霉素、壯觀霉素、氟甲砜霉素、增效磺胺、硫化酰胺及氟喹諾酮類耐藥的H.parasuis，大量菌株對四環素、紅霉素、氨基糖苷類和林可霉素有明顯的抵抗力。隨著對中藥研究的深入， 大量的報道顯示許多中藥具有抑菌殺菌的作用，且沒有出現耐藥的情況。中藥的成分多種多樣，中藥的活性物質也多種多樣，因此其抑菌殺菌的機制也更加全面[4-5]。本次試驗表明，以鹽酸小檗堿抑菌效果最好，MIC為16 μg/mL，大多維持在64-128 μg/mL之間。許多不具備抑菌作用的中藥，對病原菌依舊有效。無殘留且不易產生耐藥性的中藥，有潛力成為新型的抗生素。

表1 14種中藥單體對H.parasuis的最小抑菌濃度結果

[1] 郭蕊.副豬嗜血桿菌病細菌分離及PCR檢測方法的建立與應用[J].今日畜牧獸醫,2015(5):26-28.

[2] 范國英,劉俊偉,王順崗,等.副豬嗜血桿菌病的診斷與治療試驗[J].黑龍江畜牧獸醫,2011(12):82-83.

[3] Head N E, Yu H.Cross-sectional analysis of clinical and environmental isolates of pseudomonas aeruginosa: Biofilm formation, virulence and genome diversity [J]. Infect Immun, 2004,72(1):133-144.

[4] 傅若秋,盧來春,李卓恒,等.31種中藥單體對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌作用研究[J].中國藥業,2014,23(4):20-22.

[5] 范國英,劉俊偉,王順崗,等.副豬嗜血桿菌病的診斷與治療試驗[J].黑龍江畜牧獸醫,2011(12):82-83.